[发明专利]一种用酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的方法及其试剂盒

说明书

本发明提供一种酶标仪酶法定量检测乳果糖的方法及其试剂盒。本发明采用果糖建立标准曲线，解决了酶标仪检测中无法定量的技术问题，使检测方法因采用酶标仪而极大的提高的检测效率，降低了检测试剂用量。另一方面，本发明通过将葡萄糖氧化酶与过氧化氢酶，NADP⁺与ATP分别按一定比例混合后进行冻干，将己糖激酶和葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶混合后制成悬浮液的处理方法进行检测试剂的制备，不仅不干扰检测反应及其效果，还减少了试剂添加步骤，简化了操作，提高了检测的准确性。

技术领域

本发明涉及一种采用酶标仪利用酶化学法定量测定液态奶中乳果糖的方法及其试剂盒，属于酶化学分析检测领域。

背景技术

乳果糖是乳糖在牛奶热处理过程中发生碱基异构的产物，与乳糖是同分异构体，是评估牛奶热处理程度的一项重要指标。欧盟和IDF均提议UHT灭菌乳的乳果糖含量不得超过600mg/L。因此，乳果糖的准确测定十分重要。

目前，国内外关于液态奶中乳果糖的检测方法都比较复杂，一般为高效液相色谱法和基于酶分析的分光光度法。其中高效液相色谱法因样品中乳糖含量高于乳果糖的数十倍，在分离中乳糖与乳果糖间很难达到基线分离，从而使定量检测乳果糖存在较大难度。基于酶分析的分光光度法则是采用标准摩尔吸光系数定量的方法(例如在NY/T 939-2016和ISO 11285-2004等标准中记载的酶分析分光光度法)，存在样品处理繁琐、测定时需采用比色皿分别进行测定、检测通量小、耗时长的问题，在大批量样品测定中该问题更为突出。另外，酶分析分光光度法，整个测定过程中使用的酶的种类较多，需分别进行配制，酶试剂用量大，不但检测成本高，且酶活性难以保障，直接影响测定结果。随着近年来酶标仪测定技术的不断成熟，运用酶标仪提高检测通量，降低检测成本，可能成为测定乳果糖的一种新途径，但是如何去除乳糖的干扰，对乳果糖进行准确定量仍然是一道难题。

发明内容

针对目前使用的酶分析分光光度法定量检测液态奶中乳果糖，测定步骤繁琐、检测效率低、检测成本高，对操作人员技术要求高，须经较长时间的专门培训才可独立操作等缺点，开发了利用酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的方法，以及相应的检测试剂盒。

本发明所利用的酶化学原理，与标准的分光光度法测定液态奶中乳果糖含量所用的酶化学原理相同，故标准NY/T 939-2016全文引用在本发明中作为参考。

在采用酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖含量的方法中，酶标仪无法采用分光光度计法的朗伯比尔定律定量的方法，需要建立新的定量手段。经过研究考察，本发明的发明人采用果糖为标准品，建立果糖的标准曲线，用于酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的含量，不仅解决了酶标仪法测量中无法定量的技术问题，还避免了采用其他物质为标准品，例如，以乳果糖为标准品，需经多个步骤酶解带来的方法学误差。

本发明的第一个方面是，提供一种酶标仪酶法定量检测液态奶中乳果糖的方法，其包括如下步骤：以果糖为标准品建立标准曲线。

根据本发明，所述标准曲线的建立步骤包括：在酶标仪用微孔板中加入果糖标准品溶液，使每孔中果糖质量依次呈等差增长或呈倍数增长，加入NADP⁺和ATP后混匀；再加入己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶混匀后反应，在酶标仪上340nm处读取溶液OD值，记为A₁，再加入磷酸葡萄糖异构酶混匀后反应，在酶标仪上340nm读取溶液OD值，记为A₂；以(A₂-A₁)的值为净OD值，作为纵坐标，以每孔中果糖质量为横坐标，绘制标准曲线或计算回归方程。

优选，在微孔板中的4-10个孔中加入果糖标准品溶液。

优选，每孔中的果糖质量以μg为单位。