[发明专利]一种利用CRISPR/Cas9系统对紫花苜蓿基因定点突变的方法

权利要求书

1.一种利用CRISPR/Cas9系统对紫花苜蓿基因定点突变的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤(1)构建紫花苜蓿中通用的由根癌农杆菌介导转化的双元表达载体MsCRISPR/Cas9；所述双元表达载体MsCRISPR/Cas9的全序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤(2)针对紫花苜蓿中的目标基因设计基于CRISPR/Cas9的靶标序列，将含有编码所述靶标序列的DNA片段连接到紫花苜蓿中通用的载体MsCRISPR/Cas9中构建载体MsCRISPR/Cas9::target；

步骤(3)使用根癌农杆菌介导转化紫花苜蓿，实现对紫花苜蓿中特定基因的定点突变；

所述的在紫花苜蓿中表达CRISPR/Cas9系统的双元表达载体MsCRISPR/Cas9的骨架载体是pCambia1300载体，所述的pCambia1300骨架载体上有一段用于转化植物的T-DNA区域，所述T-DNA区域包含一个左边界重复序列LB repeat、一个右边界重复序列RB repeat以及左右边界序列内部的用于转化的序列，所述的T-DNA区域左右边界内部用于转化的序列中包含表达抗植物筛选剂潮霉素的蛋白的Hpt基因表达元件、表达Cas9蛋白的表达元件、表达sgRNA的表达元件以及sgRNA表达元件内部两个AarⅠ酶切位点之间的靶点序列，所述Hpt基因表达元件内部包含启动Hpt基因转录的CaMV 35S promoter enhanced启动子序列、表达Hpt基因的CDS序列和终止Hpt基因转录的Camv poly A终止序列，所述表达Cas9蛋白的表达元件内部包含启动Cas9序列转录的2xCaMV 35S promoter启动子序列、表达Cas9的DNA序列和终止Cas9转录的Nos terminator终止序列，所述表达sgRNA的表达元件内部包含启动sgRNA序列转录的蒺藜苜蓿MtU6启动子序列和包含有表达sgRNA的DNA序列；

所述的MtU6启动子的序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9系统对紫花苜蓿基因定点突变的方法，其特征在于，所述目标基因包括紫花苜蓿基因组中任何有生物学功能的基因或DNA序列。

3.如权利要求1-2任一所述的利用CRISPR/Cas9系统对紫花苜蓿基因定点突变的方法，其特征在于，所述表达载体MsCRISPR/Cas9::target构建方法操作如下：

步骤(1)根据靶点序列设计一对oligo引物18-24bp，能形成如下两端带有接头的DNA片段，并合成：

5’-T T T G N_16-23-3’

3’-C N_16-23 C A A A-5’；

步骤(2)将上述合成的引物对进行退火反应，形成带粘性末端的互补oligo引物二聚体双链片段；

步骤(3)使用AarI限制性内切酶酶切双元表达载体MsCRISPR/Cas9；经小牛碱性磷酸酶CIP去磷酸化反应后在0.8-1.2％的琼脂糖凝胶中进行电泳分离，回收纯化线性载体；

步骤(4)将退火磷酸化后带粘性末端的互补DNA双链片段DNA与回收纯化的MsCRISPR/Cas9线性载体使用T4DNA连接酶在16℃水浴锅中连接10-16h；

步骤(5)将连接产物通过热击法转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞，复苏后涂布于含50mg/L卡那霉素的LB平板培养基上，37℃培养箱培养12-16h；

步骤(6)挑取单菌落克隆于1.5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床摇12-16h；

步骤(7)使用测序引物MtU6-T-F对单克隆菌液进行测序，选择靶点连接正确的单克隆于50-100ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃摇床摇12-16h，提取质粒。

4.如权利要求3所述的利用CRISPR/Cas9系统对紫花苜蓿基因定点突变的方法，其特征在于，所述测序引物MtU6-T-F的序列如SEQ ID NO.4所示。