[发明专利]一种N-MDPV检测引物和探针及其应用

说明书

本发明提供一种N‑MDPV检测引物和探针及其应用，所述引物和探针序列如下：上游引物NMM‑F：5’‑TACGAATGAACAAACCAA‑3’，下游引物NMM‑R：5’‑CGCTCTTAATATCTCCTCTA‑3’，探针NMM‑P序列为：5’‑TGAACGAGCGAATGAGCCTTCC‑3’，其5’‑端标记荧光报告基团FAM，3’‑端标记荧光淬灭基团Eclipse。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，可检测N‑MDPV感染，为后续研究N‑MDPV的致病机理和开展分子流行病学奠定基础。

技术领域

本发明涉及一种N-MDPV检测引物和探针及其应用，属于鸭病学领域。

背景技术

实时荧光定量PCR方法（Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针（荧光共振能量传递探针）和分子信标（molecular Beacon）。TaqMan探针法是指Real-time PCR 扩增时在加入一对引物时，还同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团，如Eclipse、TAMRA、BHQ等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号。随着Real-time PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与Real-time PCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。由于TaqMan实时荧光定量探针在常规SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的基础上，加入一条更特异性的探针，使检测目的基因只有和TaqMan探针特异性的结合，才能检测到阳性扩增信号，使检测结果更特异性，避免了SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法可能导致的结果误读误判，被广泛应用于病原学检测领域。

新型番鸭细小病毒（novel Muscovy duck parvovirus，N-MDPV）为近年来鸭群新发传染病。通过对N-MDPV分离株（NM100株）进行基因组序列测序分析发现，其基因组为5073nt，具有MDPV基因组结构特征。经序列比对分析发现，其与番鸭细小病毒重组株（SAAS-SHNH株）核苷酸序列同源性最高为99.5%，与经典MDPV代表株（FM株）基因组核苷酸同源性为93.7%，与经典GPV代表株（B株）基因组核苷酸同源性为85.5%。经遗传进化分析发现，NM100株在基因组全长、VP1基因的遗传进化上与MDPV处于同一大的遗传分支，但在VP3基因遗传进化上却与GPV处于同一大的遗传分支；与2015年感染樱桃谷鸭的新型GPV（novel gooseparvovirus, N-GPV）分离株差别较大，两者之间的基因组核苷酸同源性仅为85.4%，并处于不同的遗传进化分支。通过Simplot 3.5.1同源重组分析发现，NM100株与MDPV代表株FM株、鹅细小病毒活疫苗SYG61v株在419-610位（位于左侧ITR的3’端和NS的5’端）和3116-4249位（位于VP3基因）存在两处同源重组 [Wan C, et al. Complete Genome Sequence of aNovel Duck Parvovirus Isolated in Fujian, China. Kafkas Univ Vet Fak, 2016,22: 971-975.）]。