[发明专利]一种提高三叶青外植体消毒灭菌效果的方法

说明书

提高三叶青外植体消毒灭菌效果的方法：用七种含有碳纳米管或石墨烯量子点的溶液或培养液依次对三叶青外植体进行处理，可显著减少三叶青外植体的污染率。本发明与现有技术比较，三叶青外植体消毒灭菌后成活率高、污染率小、生长速度快。

技术领域：

本发明涉及一种提高植物外植体消毒灭菌效果的方法，确切地说是一种提高三叶青外植体消毒灭菌效果的方法。

背景技术：

三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)，学名三叶爬崖藤，各地俗称金线吊葫芦、三叶对、三叶扁藤、破石珠、雷胆子、一粒珠，块根被称为蛇附子等，是葡萄科崖爬藤属多年生蔓生藤本植物，是我国特有珍稀中药植物。三叶青主要分布于我国浙江、湖南、江西、福建、广西、重庆、湖北、四川、广东、贵州等地，喜阴，野生三叶青多生于背阳潮湿山坡，山涧和溪谷旁林下；三叶青适合亚热带季风和温带季风湿润等气候、降雨量需超过800mm、年平均气温高于15℃、日照绵长、植被丰富的西南高原、长江中下游流域和东南沿海丘陵等区域。三叶青临床主要用于治疗小儿高热惊厥、腹痛、肺炎、哮喘、肝炎、肿瘤等症，且疗效显著。怀玉山三叶青分布在江西怀玉山山脉，2016年3月获批为国家地理标志农产品。但由于过度采挖野生三叶青，导致三叶青存量急剧下降，价格成倍增长，市场供不应求。应用组织培养进行三叶青的快速繁殖，可以解决三叶青资源紧缺的问题。建立无菌体系是三叶青离体快繁的第一关，也是三叶青产业化生产最关键的环节。目前，采用常规的消毒灭菌方法，三叶青外植体的污染率高，成活率低，生长速度慢，导致生产效率不高，生产实践应用较为困难。针对这些问题，本发明开发了一种提高三叶青外植体消毒灭菌效果的方法，可为三叶青无菌体系的建立提供技术基础。

发明内容：

本发明的目的是提供一种污染率小、成活率高、生长速度快的提高三叶青外植体消毒灭菌效果的方法。实现本发明目的的技术方案是，一种提高三叶青外植体消毒灭菌效果的方法，其特征在于有以下步骤：(1)取出三叶青外植体，并将其浸泡于溶液一：0.3-0.5g/L碳纳米管；(2)在培养液一中浸泡0.5h后，将三叶青外植体浸泡于溶液二：0.3-0.5g/L石墨烯量子点；(3)在培养液二中浸泡0.5h后，将三叶青外植体浸泡于溶液三：0.3-0.5g/L碳纳米管+0.3-0.5g/L石墨烯量子点；(4)在培养液三中浸泡0.5h后，将三叶青外植体转移到超净工作台内，浸泡于溶液四：0.3-0.5g/L碳纳米管+0.3-0.5g/L石墨烯量子点+70％-75％酒精，按常规时间消毒；(5)按常规方法洗涤后，将三叶青外植体浸泡于溶液五：0.3-0.5g/L碳纳米管+0.3-0.5g/L石墨烯量子点+0.1％氯化汞，按常规时间消毒；(6)按常规方法洗涤后，将三叶青外植体浸泡于培养液一：MS+0.3-0.5g/L碳纳米管+30g/L；(7)在培养液一中浸泡10min后，将三叶青外植体浸泡于培养液二：MS+0.3-0.5g/L石墨烯量子点+30g/L蔗糖；(8)在培养液二中浸泡10min后，将三叶青外植体吸干水分后接种于培养基上，放于常规条件下培养，可显著减少三叶青外植体的污染率。

具体实施方式：

结合下述实施例对本发明作进一步说明：

(1)第一次处理

取出三叶青外植体，并将其浸泡于溶液一：0.3-0.5g/L碳纳米管；

(2)第二次处理

在培养液一中浸泡0.5h后，将三叶青外植体浸泡于溶液二：0.3-0.5g/L石墨烯量子点；

(3)第三次处理

在培养液二中浸泡0.5h后，将三叶青外植体浸泡于溶液三：0.3-0.5g/L碳纳米管+0.3-0.5g/L石墨烯量子点；

(4)第四次处理