[发明专利]半滑舌鳎来源的外泌体夹心ELISA检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种半滑舌鳎来源的外泌体夹心ELISA检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

（1）样品收集：半滑舌鳎收集精液样本，收集精液后分别混样，进行精浆外泌体分离；

（2） 对外泌体提取后进行蛋白定量，然后分装保存于-80 ℃备用；

（3） 包被：按照100μL/孔将抗CD63的抗体加入酶标板孔中，孵育一定时间后移除悬液；

（4） 封闭：按照300μL/孔将封闭液加入酶标板孔中，孵育一定时间后移除封闭液并拍干；

（5） 检测：向每孔中加入100μL 外泌体悬液，再加入50μL辣根过氧化物酶标记的抗HSP90抗体，混匀后孵育一定时间，移除并拍干，随后洗涤三次，拍干，再加入100μL/孔底物进行显色反应；

（6） 终止：按照100μL/孔加入酸性终止液，终止反应；

（7） 读数：采用双波长法以酶标仪进行读数，得到OD值；

（8） 判定结果：P/N值≥2.1则判定为阳性；对OD值及浓度作图，得到标准曲线。

2.根据权利要求1所述的一种半滑舌鳎来源的外泌体夹心ELISA检测方法，其特征在于所述步骤（3）的包被：先将抗CD63的鼠源单克隆抗体以碳酸盐缓冲液稀释，然后再包被于96孔酶标板上。

3.根据权利要求1所述的一种半滑舌鳎来源的外泌体夹心ELISA检测方法，其特征在于所述步骤（3）中包被缓冲液为0.05M碳酸盐缓冲液pH=9.6。

4.根据权利要求1所述的一种半滑舌鳎来源的外泌体夹心ELISA检测方法，其特征在于所述步骤（5）的孵育反应温度为35-37℃，反应时间为1-2 小时。

5.根据权利要求1所述的一种半滑舌鳎来源的外泌体夹心ELISA检测方法，其特征在于步骤（8）标准曲线的构建方法具体包括：将外泌体倍比稀释为不同的浓度作为抗原进行检测，并根据其对应的OD值构建标准曲线。