[发明专利]一种基于CYP703A3基因的转基因水稻不育系的培育方法

权利要求书

1.一种基于CYP703A3基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在于它包括以下步骤：

A、水稻基因表达盒CYP703A3的获得；

B、sfGFP基因表达盒的获得；

C、小麦花粉致死基因Ki的扩增；

D、小麦花粉特异性启动子Pg47的扩增；

E、各基因表达元件的连接。

2.根据权利要求1所述基于CYP703A3基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在于所述步骤E、各基因表达元件的连接步骤包括：

第一步，连接CYP703A3，利用上下游引物中引入的Smal和CcoI酶切位点和pCAMBIA1300双元载体上的Smal和CcoI酶切位点，将完整的水稻CYP703A3基因连接到pCAMBIA1300载体上；

第二步，利用上下游引物中引入的Tru1I和Kpn I酶切位点和pCAMBIA1300双元载体上Tru1I和KpnI酶切位点，将sfGFP基因表达元件连接到第一步已经连接上水稻CYP703A3基因的pCAMBIA1300载体上；

第三步，利用上下游都引入的Msel酶切位点，将小麦花粉致死基因Ki通过单酶切位点连接到已经连有水稻CYP703A3基因和sfGFP基因表达元件的pCAMBIA1300双元载体上；

第四步，利用上下游引物中引入Kpn I和Sma I酶切位点和pCAMBIA1300双元载体上的Kpn I和Sma I酶切位点，将小麦花粉特异性启动子Pg47连接到前三步已经连接上水稻CYP703A3基因、sfGFP基因表达元件和小麦花粉特异性启动子Pg47的pCAMBIA1300载体上。

3.根据权利要求1所述基于CYP703A3基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步骤A、水稻基因表达盒CYP703A3的获得，进一步包括：

提取水稻植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以F2/R2为上下游引物进行完整CYP703A3基因表达盒的扩增，扩增过程中分别在上游引物和下游引物中引入Sma I和CcoI酶切位点，其扩增的水稻CYP703A3基因包含其上游的启动子和下游的终止子，同时包含所有的外显子和内含子。

4.根据权利要求1所述基于CYP703A3基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步骤B、sfGFP基因表达盒的获得，进一步包括：

以含有sfGFP基因完整表达盒的质粒为模板，以F1/R1为上下游引物进行扩增，扩增过程中分别在上下游引物中引入Tru1I和Kpn I位点，同时在下游引物引入的Kpn I位点前面加入Msel酶切位点。

5.根据权利要求1所述基于CYP703A3基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步骤C、小麦花粉致死基因Ki的扩增，进一步包括：

以小麦基因组DNA为模板，以F3/R3为上下游引物进行小麦致死基因Ki的扩增，在上下游引物中引入Msel酶切位点；其扩增的致死基因Ki包含所有的外显子和内含子。

6.根据权利要求1所述基于CYP703A3基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步骤D、小麦花粉特异性启动子Pg47的扩增，进一步包括：

以小麦基因组DNA为模板，以F4/R4为上下游引物进行花粉特异性启动pPG47扩增，在上下游引物中分别引入Kpn I和Sma I酶切位点。

7.权利要求1～6中任一项所述方法选育的基于CYP703A3基因的转基因水稻不育系。

8.权利要求1～6中任一项所述基于CYP703A3基因的转基因水稻不育系的培育方法在水稻不育系育种中的应用。