[发明专利]一种基于CYP704B2基因的转基因水稻不育系的培育方法

说明书

本申请公开了一种基于CYP704B2基因的转基因水稻不育系的培育方法，包括以下步骤A、EYFP基因表达盒的获得；B、小麦花粉致死基因Ki的扩增；C、小麦花粉特异性启动子Pg47的扩增；D、水稻基因表达盒CYP704B2的获得；E、各基因表达元件的连接。所述步骤E、各基因表达元件的连接，包括：首先将EYFP基因表达元件、小麦花粉致死基因Ki和小麦花粉特异性启动子Pg47连接到pCAMBIA1300载体上，再将完整的水稻CYP704B2基因引入到连接到复合载体上。本发明F1代杂合体在自交结实过程中遵循孟德尔分离定律，产生的后代既有能保持三连锁基因的杂合体，又有无育性的不育系。

技术领域

本发明属于基因工程遗传育种学技术领域，具体涉及一种基于CYP704B2基因的转基因水稻不育系的培育方法。

背景技术

水稻原产亚洲热带，在中国广为栽种后，逐渐传播到世界各地。水稻是世界上近一半的人口的主食，除可食用外，还可以酿酒、制糖和作为工业原料大。多年来的生产实践表明，杂交水稻一般可比常规稻增产20％以上，因此杂交水稻彰显着巨大的增产潜力。

杂交水稻的发展依赖于杂交水稻不育系的培育。我国杂交水稻的研究始于上个世纪60年代，70年代开始大规模被种植。第一代杂交水稻是以核质互作雄性不育系为遗传工具的三系法，第二代杂交水稻是以光温敏雄性不育系为遗传工具的两系法，“三系法”和“两系法”杂交育种技术对粮食增产贡献巨大，但也存在问题。三系法中可利用的具有优良形状的父母本有限，配组不自由，野败保持系频率较低。

生产上现有的不育系间遗传差异小，杂交种育性稳定性不够，抵御逆境能力较差。而“两系法”中光温敏雄性不育系的育性受外界温度控制，易导致光温敏不育系自交结实，制种失败。因此开发新一代不育系对杂交水稻的发展至关重要。

水稻CYP704B2基因是bHLH转录因子中的一员，bHLH转录因子大部分参与花药绒毡层的发育或小孢子发育。花药绒毡层对花粉的生长发育至关重要，绒毡层分泌的胼胝质酶能够适时地分解花粉母细胞和四分体的胼胝质壁，以保证小孢子彼此分离。而水稻CYP704B2基因突变后会导致绒毡层细胞不能及时降解，程序性死亡延迟，从而绒毡层分泌的胼胝质酶影响到小孢子的发育和分离，最终表现为不育。

发明内容

本发明将水稻普通核不育基因CYP704B2与小麦花粉致死基因Ki连锁，同时以黄色荧光蛋白基因EYFP作为报告基因，对水稻CYP704B2突变体进行基因改造，获得F1代杂合体。F1代杂合体在自交结实过程中遵循孟德尔分离定律，产生的后代既有能保持三连锁基因的杂合体，又有无育性的不育系。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：一种基于CYP704B2基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在于它包括以下步骤：

A、EYFP基因表达盒的获得；

B、小麦花粉致死基因Ki的扩增；

C、小麦花粉特异性启动子Pg47的扩增；

D、水稻基因表达盒CYP704B2的获得；

E、各基因表达元件的连接。

所述步骤E、各基因表达元件的连接步骤包括：

第一步，利用上下游引物中引入的Tru1I和Kpn1酶切位点和pCAMBIA1300双元载体上Tru1I和Kpn1酶切位点，将EYFP基因表达元件连接到pCAMBIA1300载体上；

第二步，利用上下游都引入的Msel酶切位点，将小麦花粉致死基因Ki通过单酶切位点连接到已经连有水稻EYFP基因表达元件的pCAMBIA1300双元载体上；