[发明专利]一种基于C6基因的转基因水稻不育系的培育方法

权利要求书

1.一种基于C6基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在于它包括以下步骤：

A、小麦花粉致死基因Ki的扩增；

B、小麦花粉特异性启动子Pg47的扩增；

C、mCerulean基因表达盒的获得；

D、水稻基因表达盒C6的获得；

E、各基因表达元件的连接。

2.根据权利要求1所述基于C6基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在于所述步骤E、各基因表达元件的连接步骤包括：

第一步，利用上下游都引入的Msel酶切位点，将小麦花粉致死基因Ki通过单酶切位点连接到pCAMBIA1300双元载体上；

第二步，利用上下游引物中引入Kpn I和Sma I酶切位点和pCAMBIA1300双元载体上的Kpn I和Sma I酶切位点，将小麦花粉特异性启动Pg47连接到第一步已经连接上小麦花粉致死基因Ki的pCAMBIA1300载体上；

第三步，利用上下游引物中引入的Tru1I和Kpn1酶切位点和pCAMBIA1300双元载体上Tru1I和Kpn1酶切位点，将mCerulean基因表达元件连接到前两步已经连接上小麦花粉致死基因Ki和小麦花粉特异性启动子Pg47的pCAMBIA1300上；

第四步，连接C6，利用上下游引物中引入的Smal和Sau96I酶切位点和pCAMBIA1300双元载体上的Smal和Sau96I酶切位点，将完整的水稻C6基因引入已经连有小麦花粉致死基因Ki和小麦花粉特异性启动子Pg47和mCerulean基因表达元件的pCAMBIA1300载体上。

3.根据权利要求1所述基于C6基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步骤A、小麦花粉致死基因Ki的扩增，进一步包括：

以小麦基因组DNA为模板，以F3/R3为上下游引物进行小麦致死基因Ki的扩增，在上下游引物中引入Msel酶切位点；其扩增的致死基因Ki包含所有的外显子和内含子。

4.根据权利要求1所述基于C6基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步骤B、小麦花粉特异性启动子Pg47的扩增，进一步包括：

以小麦基因组DNA为模板，以F4/R4为上下游引物进行花粉特异性启动pPG47扩增，在上下游引物中分别引入Kpn I和Sma I酶切位点。

5.根据权利要求1所述基于C6基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步骤C、mCerulean基因表达盒的获得，进一步包括：

以含有mCerulean基因完整表达盒的质粒为模板，以F1/R1为上下游引物进行扩增，扩增过程中分别在上下游引物中引入TrulI和Kpn I位点，同时在下游引物引入的Kpn I位点前面加入Msel酶切位点。

6.根据权利要求1所述基于C6基因的转基因水稻不育系的培育方法，其特征在，所述步骤D、水稻基因表达盒C6的获得，进一步包括：

提取水稻植株的基因组DNA，以基因组DNA为模板，以F2/R2为上下游引物进行完整C6基因表达盒的扩增，扩增过程中分别在上游引物和下游引物中引入Sma I和Sau96I酶切位点，其扩增的水稻C6基因包含其上游的启动子和下游的终止子，同时包含所有的外显子和内含子。

7.权利要求1～6中任一项所述方法选育的基于C6基因的转基因水稻不育系。

8.权利要求1～6中任一项所述基于C6基因的转基因水稻不育系的培育方法在水稻不育系育种中的应用。