[发明专利]一种用于BKV的早期诊断和检测体系及其应用

说明书

本发明公开一种用于BKV的早期诊断和检测体系及其应用，具体提供了一种用于BKV早期诊断和检测的引物探针体系，包含上述引物探针的试剂盒以及他们的用途。本发明的引物探针体系覆盖度更广、特异性强、灵敏度更高，具有更大的临床应用潜力，利于有效预防BKV相关疾病，提高肾移植受者的生存质量。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种用于BKV的早期诊断和检测体系及其应用。

背景技术

BK多瘤病毒(BK polyomavirus，BKV)是一种潜伏感染的机会性病毒，在普通人群中的感染率高达85％以上。BKV一旦活化会严重威胁免疫力低下人群(器官移植术后免疫抑制剂服用者、HIV感染者、孕妇和老人)。包括：1)能引起1-10％的肾移植受者发生BKV相关肾病，若未及时有效的抑制BKV活化会导致移植肾失功；2)能引起大约10％的造血干细胞移植受者发生出血性膀胱炎；3)BKV感染增加了患一些泌尿系统肿瘤(如膀胱癌)的风险。目前，除了削减免疫抑制剂(增加了器官排斥的风险)外无有效的抗BKV手段，有统计表明即使在药物治疗下BKV相关肾病仍会导致16-40％的移植肾失功，在一些小样本量研究中失功率甚至更高。因此，BKV的早期诊断和定量监测对于预防BKV相关疾病的发生和评价BKV相关疾病的治疗效果至关重要。在病毒的诊断方法中，荧光探针法实时定量聚合酶链式反应检测体液(如尿液和血浆)中的病毒DNA因无/低创伤、操作简单、设备要求低、特异性强、灵敏度高等优势，是临床上应用普遍的快速诊断和定量的方法。

荧光探针法实时定量聚合酶链式反应：利用与BKV保守序列对应的特异性引物和荧光标记探针，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增靶片段并收集荧光信号，进而识别样品中有无BKV的DNA并进行定量。目前利用这一原理的定量检测技术常见于文献中，采用这种技术的商业化试剂盒也有在售。

但现有的体系都具有如下缺陷：1.靶点位置不是最佳。根据已有的文献报道和商业化试剂盒的说明书，BKV定量检测的常规靶标为病毒的LT抗原基因和VP1基因，二者作为定量PCR靶点都有一定缺陷。(1)靶向LT抗原基因的缺点。1)LT序列中A/T碱基含量很高(64％左右)，因此引物和探针的特异性差；2)LT抗原编码区可能会缺失一段序列从而影响靶向这一部分的诊断和定量：BKV在复制过程中在LT抗原编码区缺失片段的报道并不罕见，2016年WHO推荐的BKV定量检测标准品病毒中有70％的毒株在LT区缺失超过1.5kb的碱基对(Bateman et al,Clin Chem,2017)；我们通过全基因测序发现从ATCC订购的BKV标准株中也有约1/5的毒株在LT编码区缺失了246对碱基。因此如果引物或探针恰巧靶向易缺失的片段则会造成假阴性或BKV检测水平低于实际水平的情况。(2)靶向VP1基因。BKV的VP1序列保守性相对较弱，根据VP1基因序列可将BKV分成四个亚型，最为常见的I型和IV型还可根据序列和血清学特征细分成许多亚亚型，因此在VP1区域选取高度保守的引物探针序列比较困难：我们在进行临床样本检测时也发现一例尿液样本用文献中靶向VP1的引物探针系统(表2第4号体系)诊断结果为BKV阴性，但使用本发明设计的4组引物探针却能检测到较高的BKV尿液载量。通过病毒全基因组测序我们发现此病毒为IV型，且在探针(以I型为模板)靶向区域与I型BKV有5个碱基的差异(图3)。

2.不断有新的BKV全基因组序列被测序，对引物和探针的靶点位置和保守性提出了新的要求。随着对BKV研究的积累，新的毒株序列不断被发现并上传到NCBI基因库中。我们在早期研究中也测序到12条新的BKV全基因组序列。通过比对排列截至目前NCBI上已有的315条(其中有一株序列完整度较差未列入下文序列阵中)加上我们测序的12条BKV全基因组序列，再带入已报道的引物和探针序列进行比对，我们发现这些引物和探针已经无法有效覆盖所有的BKV毒株，一些体系的引物探针序列(GC含量和退火温度等方面)也有待优化(表2)。这就要求我们更新这一定量诊断体系，设计BKV毒株覆盖度更高、特异性(排除其他病毒特别是其近亲JC病毒的干扰)更强的探针法荧光定量PCR体系。

发明内容