[发明专利]一种组织工程肝脏模型的制备方法

说明书

本发明涉及一种组织工程肝脏模型的制备方法，包括如下步骤：步骤一：进行种子细胞的培养、扩增；步骤二：准备模型构建的液体和基质；步骤三：进行细胞收集；步骤四：进行模型构建。该组织工程肝脏模型由原代肝细胞，内皮细胞和肝星状细胞组成，形成类似天然肝脏组织的胆管样结构，并具有白蛋白分泌和胆汁酸转运功能，细胞色素P450活性强，线粒体功能高；与单独培养的肝细胞相比，本发明构建的肝脏组织模型白蛋白和尿素表达水平有显著提高，并且组织活力可以在体外维持到28天，能够实现长期药物暴露，为基于体外细胞的肝毒性和药效评价提供了更敏感和准确的测试模型。

技术领域

本发明属于再生医学和组织工程技术领域，具体涉及一种组织工程肝脏模型的制备方法。

背景技术

肝脏作为人体最大的内脏器官，担负着很多重要的生理功能，如生物转化糖，蛋白质、脂类、维生素、激素的代谢，合成分泌胆汁等，被誉为人体的“代谢工厂”；肝脏也是人体的“解毒工厂”，是人体内最重要的药物及其代谢产物毒性体现的器官，因此肝脏成为药物毒性和代谢研究的重要靶器官。肝毒性是新药研发失败的重要原因，大约三分之二的进入Ⅲ期临床的药物因其肝毒性而不得不终止开发，药物肝毒性也是上市药物被回收的主要原因。因此，一种有效、可靠、准确、廉价的肝毒性检测工具是非常必要的。

目前，用于药物肝毒性评价的模型包括体内模型和体外模型，体内评价模型通常是用各种实验动物，但是动物实验不仅周期长、耗费财力，并且与人类存在种属差异；体外评价常用的模型包括原代肝细胞模型、离体肝脏模型、肝脏切片模型、肝细胞系模型等。原代肝细胞模型，虽然其源自人类，具有与在体肝细胞相近的功能，但缺乏器官特异性的细胞间相互作用，丧失了其异质性和三维结构；与原代肝细胞模型相比灌注肝脏或者肝脏切片保留了肝脏的三维结构，更接近在体情况，但该技术重复难度大，人力成本高，灌注后的肝脏或者肝脏切片活力快速丧失，完整的灌注肝脏在体外只能存活2~3小时，灌注的肝脏切片也最多可以存活3~5 天，因此，无法用来进行长期/慢性的毒性评价。肝脏细胞系的特点是具有相对的无限生长能力和较高的存活率，但没有可以表达完整肝脏代谢酶系的肝细胞系；此外,细胞系的基因型和表现型也经常发生改变,没有一个细胞系模型可以保留完整的组织特异性功能，完全模拟体内情况。

器官芯片是近年来出现的新研究方向，主要是在微流控芯片上模拟生物体内环境进行细胞、组织的培养，在一定程度上真实反映了细胞-细胞，细胞-基质，细胞-环境的相互作用。构建具有生物学功能的肝脏芯片对药物评估具有重要意义，然而，目前的芯片肝脏主要是在芯片中简单的进行肝脏细胞培养，其离最终的目标还有很长的距离。

3D打印技术是目前的研究热点，在3D打印器官方面也取得了一定进展，美国加利福尼亚州Organovo公司利用装有细胞的3D打印机打印出迷你肝脏，深0.5mm，宽4mm，拥有很多与真实肝脏一样的功能，比器官芯片更具有真实的器官功能，检测结果更令人可信。然而这种技术主要面对的障碍依然是器官微血管的制造问题，许多活性细胞在3D打印完成之后就失去了活性，变成死细胞。

发明内容

本发明的目的是克服现有肝脏模型无法在体外长时间维持肝脏的结构和功能的缺陷,从而更好地进行药物代谢和毒性评价等功能检测。

为此，本发明提供了一种组织工程肝脏模型的制备方法,包括如下步骤：

步骤一：进行种子细胞的培养、扩增；

步骤二：准备模型构建的液体和基质；

步骤三：进行细胞收集；

步骤四：进行模型构建。

所述步骤一：进行种子细胞培养、扩增，包括如下步骤：