[发明专利]一种类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法

权利要求书

1.一种类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，其特征在于，该构建方法包括如下步骤：

步骤（1）：表皮细胞的准备

取原代角质形成细胞，复苏扩增后，使用P3~P7代细胞，用胰酶消化液消化，用MCDB153培养基制成单细胞悬液，按照1.0×10⁵～5×10⁵个/mL的细胞密度，接种于培养瓶中，置于37℃、5% CO₂条件下培养；

步骤（2）：表皮细胞的液下培养

取对数生长期的表皮细胞，以细胞培养液Ⅰ制成细胞密度为1.25×10⁶~2.5×10⁶个/ mL的表皮细胞悬浮液，取适量接种到含有聚碳酸酯滤膜的细胞培养小室中，置于37℃、5%CO₂条件下培养0.5～2小时；然后将细胞培养小室置于表皮模型培养皿，每只培养皿添加60～80 mL细胞培养液Ⅰ，37℃、5%CO₂条件下继续培养1～3天，每天换液，实现表皮细胞的液下培养；

所述细胞培养液Ⅰ是以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素、异丙肾上腺素、氢化可的松、表皮生长因子、腺嘌呤、转铁蛋白、L-肉碱和氯化钙配制的；

步骤（3）：表皮细胞增殖与分化调控

将上述步骤（2）中的细胞培养小室内的培养液弃掉，表皮模型培养皿内的培养液更换为细胞培养液Ⅱ，添加量为每只培养皿添加50~70 mL细胞培养液Ⅱ，使液面与细胞培养小室内细胞上表面位于同一水平线，进行气液面培养，37℃、5%CO₂条件下培养，培养时间为8~10天，培养期间每天换液，可得屏障弱化的体外重组表皮模型；

所述细胞培养液II是以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素、异丙肾上腺素、氢化可的松、表皮生长因子、腺嘌呤、转铁蛋白、L-肉碱、L-丝氨酸、棕榈酸、油酸、精氨琥珀酸、氯化钙、角质细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子配制的；

步骤（4）：类尿布皮炎重组表皮模型的构建

将步骤（3）所得到的屏障弱化的体外重组表皮模型转移至多孔板中，每孔内预先添加适量培养液Ⅱ，在每孔的表皮模型表面添加质量体积浓度为0.15%的十二烷基硫酸钠，均匀涂抹后，置于37℃，5% CO₂孵箱中后孵育24小时，清洗后即得到类尿布皮炎的重组表皮模型。

2.根据权利要求1所述的类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，其特征在于：所述细胞培养液Ⅰ是以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素0.5~5 μg/mL，异丙肾上腺素0.1~1μM，氢化可的松0.02~0.2 μg/mL，表皮生长因子1~10 ng/mL，腺嘌呤10~50 μg/mL，转铁蛋白5~12 μg/mL，L-肉碱0.001~0.1 mM和氯化钙0.03~0.2 mM配制的。

3.根据权利要求2所述的类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，其特征在于：所述细胞培养液II是以MCDB153为基础培养基，添加胰岛素0.5~5 μg/mL，异丙肾上腺素0.1~1μM，氢化可的松0.02~0.2 μg/mL，表皮生长因子1~10 ng/mL，腺嘌呤10~50 μg/mL，转铁蛋白5~12 μg/mL，L-肉碱0.001~0.1 mM，L-丝氨酸0.01~0.1 mM，棕榈酸0.01~0.05 mM，油酸0.01~0.05 mM，精氨琥珀酸0.05~0.1 mM，氯化钙1.0~1.5 mM，角质细胞生长因子1~10 ng/mL和粒细胞集落刺激因子10~20 ng/mL配制的。

4.根据权利要求1所述的类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，其特征在于：步骤（1）表皮细胞的准备中，取原代角质形成细胞，复苏扩增后，用胰酶消化液消化P3~P7代细胞，用于消化P3~P7代细胞的胰酶消化液为质量体积浓度2.5%的胰酶。

5.根据权利要求3所述的类尿布皮炎的体外重组表皮模型的构建方法，其特征在于：所述步骤（4）具体为将步骤（3）所得到的屏障弱化的体外重组表皮模型转移至多孔板中，每孔内预先添加0.9mL细胞培养液Ⅱ，在每孔的表皮模型表面添加质量体积浓度为0.15%的十二烷基硫酸钠25μL，均匀涂抹后，置于37℃，5% CO₂孵箱中后孵育24小时，然后用DPBS缓冲液将组织表面残留的液体用清洗干净，即得到类尿布皮炎的重组表皮模型。