[发明专利]黏附素蛋白Apd及其在制备副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒中的应用

说明书

本发明公开了一种黏附素蛋白Apd及其在制备副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒中的应用。本发明证实黏附素蛋白Apd位于副猪嗜血杆菌的外膜，在已知的15个血清型中都有表达，但在猪的其他细菌性病原没有该蛋白，用其作为诊断抗原具有高的敏感性和特异性。优化重组黏附素蛋白的表达和纯化的方法，获得了免疫原性和反应原性良好的重组蛋白。优化以重组黏附素蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法的组份与用量、反应条件、结果判定标准，制备了副猪嗜血杆菌的间接ELISA抗体检测试剂盒。动物试验证实了该试剂盒可用于副猪嗜血杆菌疫苗免疫和细菌感染后的抗体检测。在副猪嗜血杆菌病的综合防控和血清流行病学调查中，该试剂盒将具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术和动物传染病领域，具体涉及一种黏附素蛋 白Apd及其在制备副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒中的应 用。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是猪上呼吸道的常 在菌，属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属，为细小的球状、球杆状到长丝状 革兰氏阴性菌。在猪免疫力低下或受到应激时HPS可引起猪发生副 猪嗜血杆菌病(又称格拉瑟氏病)。HPS的急性感染可导致多发性浆膜 炎、关节炎和脑膜炎，败血症和死亡；慢性感染可引起化脓性鼻气管 炎和肺炎。HPS通常会与大肠杆菌、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌混合 感染，使疾病复杂化。该病在世界上养猪的国家和地区都有发生和流 行，在断奶仔猪中可导致30％的死亡率。由于我国猪的免疫抑制性疾 病多发，副猪嗜血杆菌病的发生和流行尤其严重。在副猪嗜血杆菌病 的血清学诊断、疫苗免疫后的抗体监测以及血清流行病学调查中，一 种特异、敏感的抗体检测方法必不可少。

细菌性病原的抗体检测方法通常难以建立，尤其是HPS有15个 血清型和27％的不能分型的菌株(Oliveira et al.,2003)。平板凝集试 验虽简单易行，可以用菌体悬液作为凝集抗原，但该方法特异性和敏 感性低，而且受凝集抗原血清型的限制，即特定血清型的抗原只能对 相应血清型的抗体做出检测。以菌体作为包被抗原进行间接ELISA， 又因为细菌的结构和组成复杂、抗原种类和数量多，包被抗原通常会 与被检血清中其他细菌类似成份的抗体发生交叉反应，导致假阳性。

早期的HPS抗体检测方法有补体结合试验、间接血凝试验和 ELISA(Oliveira etal.,2004)。补体结合试验需要绵羊红细胞和豚鼠 补体，因这些材料不易即时获得和制备，而且实验操作繁琐，现在很 少使用。间接血凝的致敏抗原和ELISA的包被抗原有两种，细菌超 声波破碎后的上清(多糖和蛋白)，或者热酚水法提取的LPS。以这 两种抗原成分建立的间接血凝和ELISA抗体检测方法非但不稳定， 还容易出现假阴性，对获得免疫保护的猪血清进行检测也会如此 (Oliveira et al.,2004)。

近年来国内有使用HPS的寡肽通透酶(OppA)(车勇良等，2015)、 细胞膨胀致死毒素(CDT)(刘双红，2016)和外膜蛋白(OMP2， OMP5)(贾爱卿等，2011)等大肠杆菌表达的蛋白作为诊断抗原建立 HPS间接ELISA的抗体检测方法。国内市场也已有荷兰BioChek公 司的副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测试剂盒，其以寡肽通透酶 (OppA)作为诊断抗原。但因为寡肽通透酶基因在HPS、大肠杆菌、 伤寒沙门氏菌和多杀性巴氏杆菌中高度保守(98％核苷酸一致性)， 细胞膨胀致死毒素在大肠杆菌中有结构和功能相似的同源蛋白(44％ 氨基酸一致性)，而外膜蛋白OMP2，OMP5在胸膜肺炎放线杆菌中 也有同源的蛋白(42％和71％氨基酸一致性)。所以此类抗体检测方 法或试剂盒会不可避免地与具有相似抗原成分的病原发生交叉反应， 导致假阳性。

发明内容