[发明专利]一种屏障功能弱化模型的构建方法

说明书

本发明涉及一种屏障功能弱化模型的构建方法，包括如下步骤:步骤一、细胞的准备；步骤二、屏障功能弱化模型的液下接种培养；步骤三、屏障功能弱化模型的气液面增殖分化培养；步骤四、屏障功能弱化模型的气液面分化抑制培养；该屏障功能弱化模型能够很好地替代动物模型，成为体外测试的核心工具，应用于婴儿护肤品及具有人体皮肤屏障修复功效的化妆品等产品的安全性及功效性体外检测。

技术领域

本发明属于组织工程学生物材料技术领域，具体涉及一种屏障功能弱化模型的构建方法。

背景技术

皮肤屏障在皮肤抵御外环境，维持内环境稳态，防止皮肤水分散失等功能方面发挥主要作用。皮肤屏障的结构基础是角质层的“砖-灰”结构。“砖”结构主要由角质层细胞及胞内蛋白膜套构成，“灰”结构主要由脂质胞封构成，“砖-灰”结构的本质是角质层蛋白膜套与脂质膜套的交联，它是角质层发挥屏障作用的基础。其发挥屏障主要由三部分组成：①角质细胞的跨膜蛋白及膜内蛋白（兜甲蛋白Loricrin，丝聚蛋白Filaggrin等）在转谷氨酰胺酶作用下互相交联形成蛋白膜套。②细胞外三大脂质（神经酰胺，胆固醇，脂肪酸）相互之间通过酯化反应交联形成脂质胞封。③蛋白膜套与胞外脂质胞封通过酯化反应进一步交联，形成高度密封的砖墙结构，共同抵御外环境，发挥屏障作用。

“砖-灰”结构组成物质的异常表达会导致角质层屏障异常，在皮肤层面表现出皮肤薄，对外部环境敏感等现象；重度的屏障功能异常是引起牛皮癣、银屑病等疾病的根源。因此，皮肤屏障的结构基础指标检测是评价化妆品原料、成品及半成品在改善或提升皮肤屏障功效方面的重要依据。

此外，当细胞从颗粒层到达角质层后，Profilaggrin被Caspase-14（CASP14）迅速去磷酸化成为Filaggrin（FLG），进而水解成天然保湿因子（PCA，UCA），在锁水保湿方面，发挥重要作用。

细胞之间的连接装置在维持机体结构与生理功能方面发挥重要作用。目前已知的连接装置有四种，紧密连接、黏附连接、桥粒连接和缝隙连接。在这些连接装置中，紧密连接对于维持表皮细胞的选择渗透性屏障功能是非常关键的。紧密连接的主要功能是：（1）紧密连接能够将上皮细胞紧密连接，使细胞不易受到破坏，因而是皮肤屏障功能的重要组成部分。（2）紧密连接结构和（或）紧密连接蛋白质能够控制分子的细胞旁通路，对分子大小、离子类型、细胞渗透性有选择性（屏障功能）。（3）它们能够分离细胞膜基底部分的脂质到胞膜顶部从而形成两个不同的膜功能区，从而阻止两个不同功能区之间的相互弥散，以保持细胞每个表面的专有功能，维持细胞的极性（分离作用）。在哺乳动物表皮中，紧密连接蛋白包括：Claudin家族蛋白、闭合蛋白Occludin、连接黏附分子家族蛋白以及紧密连接斑块蛋白，如MAGUK蛋白家族的ZO-1、ZO-2、ZO-3、扣带蛋白（Cingulin）和Symplekin蛋白以及属于细胞极性复杂蛋白质家族的aPKC， Par3和Par6。不同的紧密连接蛋白在表皮中的表达量及表达部位各不相同，如闭合蛋白和扣带蛋白仅限于颗粒层；ZO-1和Cldn-4分布与基底层；Cldn-1和MUPP-1可见于表皮的各层。

在许多的人类皮肤疾病中，紧密连接蛋白的表达都发生了不同程度的改变。正常皮肤中仅局限于表皮上层的紧密连接蛋白在寻常性银屑病、寻常性鱼鳞病、扁平苔藓表达部位增多，如Cldn-4、闭合蛋白和ZO-1。正常情况下表达部位局限的紧密连接蛋白在银屑病和其他皮肤病中表达范围增多，而正常时表达于表皮各层的Cldn-1蛋白在银屑病表皮中则表达下降，特别是在表皮下部。银屑病患者皮损附近的皮肤中紧密连接表达高于正常部位，治愈的银屑病斑块区除Cldn-4蛋白外其它紧密连接蛋白重新表达。在人类受伤皮肤区，即角质层缺失的边缘部分和再生的表皮处，紧密连接蛋白表达范围亦增多。在正常人类的表皮中闭合蛋白、ZO-1、Cldn-1和Cldn-4都强表达于发生角化的肿瘤细胞上，如癌珠。在未角化的肿瘤细胞上，Cldn-1有不同程度地表达，而ZO-1和Cldn-4则表达下降或不表达。在Bowen病中，闭合蛋白、ZO-l、Cldn-1和Cldn-4在细胞与细胞连接处也有异常的表达。