[发明专利]一种转化菰cDNA文库改良水稻品种的方法

说明书

本发明公开了一种转化菰cDNA文库改良水稻品种的方法，涉及分子生物学领域。本发明通过构建菰的cDNA文库，并通过农杆菌介导转化进入水稻基因组中，高通量改良水稻品种，在获得的转基因系中筛选具有优良基因特性的个体，转基因系与野生型相比，在株高，分蘖、抽穗期、叶形、叶色方面均呈现出明显的变化，考种分析显示23个水稻转基因系与产量提升相关。本发明具有时间短、效率高、水稻突变性状丰富。对出现变化的水稻植株进行转基因验证分析，遗传背景明确，筛选可利用的优良基因用于后续水稻靶向改良。

技术领域

本发明涉及分子生物学域，特别涉及一种转化菰cDNA文库改良水稻品种的方法。

背景技术

水稻产量关乎世界粮食安全，一直以来都是农业科技工作者关注的焦点和热点。我们目前可以通过各种手段来提高水稻产量，比如施肥打药、科学种田、合理灌溉、发展杂交稻、发展再生稻、三季稻种植、通过转基因技术改良水稻等。随着社会的进步，在我们要建设环境友好型社会和要求食品安全的情况下，大力改良水稻，节约化肥少打药是一个共识，而这里就有两点值得关注，一是发展杂交稻，例如红莲型杂交稻“路优8号”和“洛优10号’，具有高产、优质、广适、节省农药化肥；二是发掘优质基因转化水稻提高水稻产量和抗逆抗病虫害能力，如显著提高水稻产量的玉米基因shrunken-2(Sh2)，Bph14/I S抗褐飞虱基因等。

研究发现农杆菌侵染的宿主多，农杆菌转基因先在双子叶植物(如拟南芥和烟草等)中得到了应用，后来在单子叶植物(水稻、玉米、高粱、小麦等)里也得到应用。农杆菌转基因技术的高效和其具有的独特优势，使得多个大型突变体库被构建成功；研究人员可以采用一些方法如接头PCR、环化PCR,TaiL-PCR等鉴定插入位点的侧翼序列，而有的侧翼序列信息己经被提交在网站上供有需要的其他科研工作者参考和分析，好处就是省去了我们费时费力的图位克隆工作。

农杆菌介导的转基因技术的优点。1、由于插入的T-DNA序列是己知的，这就可以从正向遗传学方法研究基因和表型的关系，而且克隆基因相对简单些；2、农杆菌转基因虽然会插入多个拷贝，但是相对来说还是很低的，有利于得到纯合的能稳定遗传的单株，符合孟德尔遗传分离定律等；3、目前的研究表明T-DNA插入有偏好性，但是也有随机性，并在大型突变体库的构建中得到了应用。

菰是国家二级保护植物品种，也是水稻的近缘属，具有生物量大、抗病从，耐寒等许多优良性状，近年来被众多研究学者作为水稻育种优良基因资源库的重要来源。然而，针对菰的分子生物学研究仍处于起步阶段，菰的遗传信息获得还很不完善，对菰基因信息的有限所知严重阻碍了其作为水稻育种优良基因资源库的研究与应用，因此开发一种高效利用菰的优良基因资源库进行水稻品种改良的方法十分重要。

目前，水稻育种分为传统杂交育种和基因重组育种，传统杂交育种具有遗传背景单一，筛选周期长的缺点，无法高效富集优良基因，基因重组育种又受限于对单一基因的测序、定位和克隆，无法高通量筛选优良的转基因水稻品种。因此，开发一种快速，简单、高效的高通量转化菰的cDNA文库改良水稻品种的方法十分必要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：针对目前对菰遗传资源利用和水稻育种中存在的问题，本发明公开了一种快速，简单、高效的高通量转化菰的cDNA文库改良水稻品种的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：

一种转化菰cDNA文库改良水稻品种的方法，包含以下操作步骤：

(1)菰cDNA文库的构建；

(2)E.coli菰cDNA文库大规模质粒抽提；

(3)菰目的cDNA过表达文库质粒电转化农杆菌，方法如下：

(A)首先从-70℃取出6支农杆菌感受态放置于冰上融解；

(B)电转前加入2μL质粒DNA于100μL感受态细胞中，用枪头轻轻吹打混匀；