[发明专利]一种愈伤组织阶段的筛选方法

权利要求书

1.一种愈伤组织阶段的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，以含有DsRED片段的质粒为模板，利用引物进行扩增，获得DsRED片段；

第二步，以双元载体质粒为模板，扩增获得两端含有Kpn I和X ba I酶切位点的35S启动子片段；

第三步，将引入X ba I和BamH I酶切位点的DsRED片段插入到所述双元载体上；

第四步，将引入Kpn I和X ba I酶切位点的35S启动子连接到第三步已经连接上DsRED基因的双元载体上；

第五步，将含有35S启动子和DsRED基因的双元载体的融合质粒导入到农杆菌中，形成可以用于介导转化植物细胞的工程菌；

第六步，利用上述工程菌转化水稻的愈伤组织；

第七步，通过对第六步中转化的愈伤组织培养后，筛选转基因成功的细胞。

2.根据权利要求1所述愈伤组织阶段的筛选方法，其特征在于，所述方法进一步包括：

第八步，将诱导出的再生苗进行检测。

3.根据权利要求2所述愈伤组织阶段的筛选方法，其特征在于，所述方法进一步包括：

第八步，将诱导出的再生苗通过利用红色荧光扩增和照射进行检测，检测阳性苗和假阳性苗。

4.根据权利要求1所述愈伤组织阶段的筛选方法，其特征在于，所述第二步，进一步包括：

以商业化的pCAMBIA1300双元载体质粒为模板，通过利用35S-F 5′gggactctagaggatccTGGTGGC-3′；35S-R 5′AAGCTCCGAGGAGGTTTCCGGATA-3′扩增获得35S启动子，获取两端含有Kpn I和X ba I酶切位点的35S启动子片段。

5.一种愈伤组织阶段的筛选使用的启动子，其特征在于，所述启动子的获得方法包括：

以商业化的pCAMBIA1300双元载体质粒为模板，通过利用35S-F 5′gggactctagaggatccTGGTGGC-3′；35S-R 5′AAGCTCCGAGGAGGTTTCCGGATA-3′扩增获得35S启动子，获取两端含有Kpn I和X ba I酶切位点的35S启动子片段。

6.根据权利要求2所述愈伤组织阶段的筛选方法，其特征在于，所述第二步的PCR扩增体系包括：

7.一种愈伤组织阶段的筛选中使用的PCR扩增体系，其特征在于，所述PCR扩增体系包括：

8.一种如权利要求1～4中任一项所述愈伤组织阶段的筛选方法在水稻转基因工程中的应用。

9.一种如权利要求1～4中任一项所述愈伤组织阶段的筛选方法筛选的水稻愈伤组织。