[发明专利]一种快速筛选杀松材线虫细菌的方法

说明书

本发明公开了一种快速筛选杀松材线虫细菌的方法，先将无菌松材线虫悬浮液与待测细菌菌株培养液在96孔板中共培养，然后离心，去除上清，再加入无菌水与线虫共培养，然后统计被击倒的线虫数量，根据被击倒的线虫数量来判断细菌是否是杀松材线虫细菌。本发明的快速筛选杀松材线虫细菌方法，经过多个细菌菌株、多次重复结果表明，采用该方法对杀松材线虫进行筛选，准确率高，是一种快速且准确的杀线虫细菌筛选方法。

技术领域

本发明涉及杀松材线虫细菌的筛选技术领域，尤其涉及一种快速筛选杀松材线虫细菌的技术。

背景技术

松材线虫病是世界性的重大森林病害。日本1905年首次报道了该病害，但直到1971年才确定该病害由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起。随后，该病害扩展到中国和韩国，近年来已传入欧洲(葡萄牙和西班牙)，对多个国家的松林造成极大危害并导致巨大经济损失。由于松材线虫的严重危害性，目前该线虫是国际上很多国家重要的检疫性有害生物，在我国，松材线虫不仅列于外检名单中，同时也列于国内林业检疫性有害生物名单之首位。自松材线虫病发生以来，世界各国学者对其进行了系统研究，但致病机制尚未十分清楚，其防治也一直是个世界难题，生产上迄今仍无行之有效的防治措施。目前生产上对该病的防治主要依靠加强植物检疫以及清理林间病死树，辅以松墨天牛的化学防治和生物防治，针对病原松材线虫的防治研究较少，但该研究领域正日益受到重视。

由于化学农药对环境的负面影响及残留问题，环境友好、安全有效的生物防治技术正日益引起重视，利用生防微生物开发杀线剂是线虫生物防治研究的热点，涉及的微生物主要包括捕食线虫真菌、内寄生真菌、产毒真菌、细菌以及放线菌等。其中，细菌具有生长繁殖速度快、易人工培养、对线虫有较好的杀灭作用等特点，已成为线虫生物防治的新突破口，越来越多具有杀线活性的细菌被筛选分离。罗兰等从51株苏云金芽孢杆菌中筛选出2株对松材线虫致死率较高的菌株；朱丽梅等从马尾松林中筛选出8株对松材线虫具有较高杀线活性的细菌；牛秋红等从198株细菌中筛选出松材线虫生防细菌5株。在目前的杀线虫细菌筛选过程中，常采用将细菌发酵滤液与松材线虫互作的方式进行(2003，鄢小宁；雷敬超，2007)。然而，有大量研究表明，松材线虫体表和体内均有大量伴生细菌，赵博光等(2000)通过电子显微镜观察到线虫体表携带大量的细菌，郭道森等(2002)发现感病黑松病组织中的松材线虫和灰葡萄孢菌丝上培养的松材线虫携带活细菌的数量平均为2.9×10²个/条和3.0×10³个/条，袁为敏等(2011)报道材线虫体内存在细菌，而这些伴生细菌中的某些种类可能对松材线虫有毒杀作用，例如Paiva等(2013)测定了分离自松材线虫的47株细菌的杀线虫能力，其中40株菌株对松材线虫显示毒性。因此，杀松材线虫细菌筛选生测实验中，与线虫共培养的细菌发酵滤液中的营养物质促进了松材线虫伴生细菌的大量繁殖，可能对线虫造成毒杀，对准确评价所测细菌的杀线作用产生一定的影响。此外，有些细菌对线虫只是起麻痹作用，而非杀死作用，给统计结果造成误判，将其吸入清水中24h后有些可恢复活性(2003，鄢小宁)。构建一种准确快速高效的筛选杀松材线虫细菌的方法是个亟待解决的问题。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的上述不足，本发明的目的是提供一种快速筛选杀松材线虫细菌的方法，以实现为松材线虫的防治提供一种快速筛选生防细菌资源的方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种快速筛选杀松材线虫细菌的方法，先将无菌松材线虫悬浮液与待测细菌菌株培养液在96孔板中共培养，然后离心，去除上清，再加入无菌水与线虫共培养，然后统计被击倒的线虫数量，根据被击倒的线虫数量来判断细菌是否是杀松材线虫细菌。

所述的快速筛选杀松材线虫细菌的方法，先将无菌松材线虫悬浮液与待测细菌菌株培养液在96孔板中共培养24小时。

所述的快速筛选杀松材线虫细菌的方法，加入无菌水与线虫共培养2小时。