[发明专利]一种制备cfDNA参考品的方法

说明书

本发明提供了一种制备cfDNA标准品或参考品的方法，包括将从细胞中提取的基因组DNA进行超声打断处理，形成150‑200bp大小的DNA片段。本发明还提供了由该方法制备的cfDNA标准品或参考品及其制备用于定量和定性检测体液中游离DNA或其基因突变中产品的应用。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及基因检测、临床检验领域。

背景技术

循环游离DNA(cfDNA)是指凋亡或坏死的细胞进入血管中所释 放的DNA片段，多见于由坏死的肿瘤细胞分泌，主要存在于细胞外的 环境中，呈游离状态。主要存在于血浆或血清、脑脊液、胃液、胆汁、 淋巴液、尿液、滑膜液等体液中。

游离DNA因为检测方便快捷，而且具非侵入性等特点，那么，随 着肿瘤分子生物学的深入研究，血液中游离DNA结合各类分子生物学 检测技术，有望成为具有一定敏感性及高特异性的肿瘤临床诊断方法。 肿瘤细胞死亡后将释放自身的DNA片段到血循环中，即循环肿瘤DNA (ctDNA)。多项研究显示，血液中的循环肿瘤DNA可以作为一类特 异性的分子标志物用于肿瘤的检测和预后监测。检测游离DNA中肿瘤 特异性的基因突变具有较好的临床价值，如EGFR、KRAS和TP53基因 等这些在多种类型肿瘤中具有高突变频率的基因其检测对肿瘤的早期 诊断具有重要的临床意义。

肿瘤cfDNA片段大小在100-200bp，主要长度在166bp左右，浓度 低。随着液体活检的应用，越来越多的检测试剂盒检测的样本类型为 cfDNA，因此模拟cfDNA样本的短片段DNA制备工艺变得尤为重要。 此类短片段DNA可以作为检测试剂盒的参考品和质控品，也可以作为 一种标准品用于检测不同检测方的能力测试。

发明内容

本发明公开了一种将大片段基因组DNA制备成短片段DNA的方 法，该短片段DNA更接近和模拟了人血浆cfDNA片段大小的特点， 更适合用作人血浆cfDNA的参考品。

一方面，本发明公开了一种制备cfDNA标准品或参考品的方法， 包括以下步骤：

将从细胞中提取的基因组DNA进行超声打断处理400秒至480 秒。

进一步，上述方法还包括，超声负载率为30％至50％，以形成150 bp至200bp大小的DNA片段。

在一个具体实施例中，上述方法中使用Covaris LE220R超声打断 仪进行超声。

在一个具体实施例中，Covaris LE220R超声打断仪的设置参数为 以下参数的至少一种：

峰值入射功率值为450；

温度为7℃；

水位值为6。

在一个实施例中，上述方法中所述基因组DNA的质量为1μg至5 μg的任一值，体积可以为130μL。

在一个实施例中，所述细胞为肿瘤细胞，优选为H1975、A549、 PC9中的至少一种。

在一个实施例中，上述方法还包括以下步骤：

将来源于H1975、A549、或PC9通过超声打断形成的DNA片段 进行掺比，制备突变位点L858R、T790M、Exon19 del均为相同突变比 例的cfDNA标准品或参考品，其中突变比例优选为0.1％、5％、或20％。

在一个具体实施例中，所述超声打断处理时间优选为400秒至450 秒，例如400秒至440秒、410秒至430秒、415秒至425秒、更优选 为420秒。

在一个具体实施例中，所述负载率优选为20％至40％，例如25％ 至35％，更优选为30％。

在一个具体实施例中，所述基因组DNA的质量优选为5μg。