[发明专利]一种表达高酶活淀粉酶的方法

说明书

本发明公开了一种表达高酶活淀粉酶的方法，先敲除米曲霉中的AodevR基因，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，获得高酶活淀粉酶。本发明通过同源重组将米曲霉中的AodevR基因用选择标记基因pyrG代替，从而获得AodevR敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶，试验结果证实：AodevR的缺失显著提高了米曲霉淀粉酶的活性，第2天，AodevR敲除菌株的淀粉酶活性是参照菌株的3倍，并且在第5天增加至参照株的7倍。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种表达高酶活淀粉酶的方法。

背景技术

淀粉是自然界最丰富的原料之一，是人类食物的重要成分，在食品领域有着广泛的用途。淀粉很容易从植物中获得，价格低廉，淀粉在工业上的应用，是缓解环境污染，实现人类可持续发展的关键。淀粉利用的关键是把淀粉降解为可发酵的糖类-葡萄糖。淀粉酶能将未经蒸煮的生淀粉直接转化成葡萄糖等可发酵性糖，是最早实现工业生产并且迄今为止用途最广，产量最大的酶制剂。根据作用的方式可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶广泛分布于动物(唾液、胰脏等)、植物(麦芽、山萮菜)及微生物中。淀粉酶种类繁多，特点各异，可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生物制剂等多种领域。

获得高产淀粉酶的菌株，降低淀粉酶的生产成本成为淀粉酶工业化利用的必由之路。选育优良的菌株是酶制剂产业的核心问题。用传统的菌种生产酶制剂往往存在着产量低、工艺复杂、成本高等缺点。采用工程菌高效表达酶蛋白，是降低酶制剂生产成本、创制新型酶制剂的有效途径，也是该领域的竞争焦点。发展安全、通用、高效、规模化表达系统，是全面提高酶制剂产业技术水平的战略必争之地，对于酶制剂产业实现变革性突破具有十分重要的意义。

米曲霉具有卓越的表达和分泌酶蛋白的能力、安全性较高、遗传背景清晰，被认为是生产淀粉酶最有应用前景的菌株之一。构建高产淀粉酶的菌株，成为米曲霉生产淀粉酶工业化利用的途径之一。构建淀粉酶高产的菌株有用物理诱变、化学诱变、基因工程构建基因工程菌株等。用物理诱变和化学诱变的方法具有快捷有效的特点，但是诱变是一个随机的过程，缺乏方向性。基因工程构建菌株就有可操控的方向性，已经成为构建高产菌株的主要手段。基因敲除，能打破已有的代谢网络，代谢网络的改变，有利于获得更高产量的菌株。

米曲霉中淀粉酶转录激活因子AmyR在淀粉或麦芽糖的诱导下会激活下游淀粉酶的表达，而CreA和CreB参与调控淀粉酶转录因子AmyR的表达。米曲霉淀粉酶生产的瓶颈在于：在米曲霉培养后期存在着反抑制调控，其会抑制米曲霉淀粉酶的生产，虽然这方面有研究通过删除单creA和双creA/creB基因片段，一定程度上提高了在高浓度培养后期的淀粉酶活性，但效果不是很明显。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种表达高酶活淀粉酶的方法，通过同源重组将米曲霉中的AodevR基因用选择标记基因pyrG代替，从而获得AodevR敲除菌株，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，可以获得高酶活淀粉酶。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种表达高酶活淀粉酶的方法，先敲除米曲霉中的AodevR基因，然后利用该菌株进行淀粉酶的表达，获得高酶活淀粉酶。

所述的表达高酶活淀粉酶的方法，通过同源重组将米曲霉中的AodevR基因用选择标记基因pyrG代替，从而实现AodevR敲除。

所述的表达高酶活淀粉酶的方法，具体步骤如下：

1)利用PrimeStar PCR聚合酶扩增AodevR基因两侧片段和pyrG基因；并电泳检测确定扩增成功；

2)纯化电泳凝胶中DNA，获得AodevR基因两侧片段与pyrG基因片段；

3)将AodevR基因两侧片段与pyrG基因融合，并电泳确认融合成功；