[发明专利]毛蚶金属硫蛋白酶--一种新型海洋生物污染检测标记物

说明书

本发明公开了毛蚶金属硫蛋白酶基因，毛蚶金属硫蛋白酶基因为克隆基因；通过基因克隆技术克隆获得。本发明还公开一种新型海洋生物污染检测标记物，用毛蚶作为检测海洋污染的生物样本，毛蚶金属硫蛋白酶用作海洋污染的检测标记物，再利用荧光定量技术检测毛蚶金属硫蛋白酶在血细胞和腮中的相对表达量。本发明毛蚶金属硫蛋白酶在毛蚶的血细胞和腮中毛蚶金属硫蛋白酶基因的相对表达量最高，克隆用PCR反应体系能保证扩增反应的特异性、提高PCR扩增效率；本发明检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及毛蚶金属硫蛋白酶--一种新型海洋生物污染检测标记物。

技术背景

我国东海地区海域带处于海洋与陆地的过渡地带，陆地工农业生产、海洋产业开发等排放的废水多在此汇集。其中重金属、石油类(BAP)等污染物易通过吸附等作用结合到悬浮颗粒物或胶体表面而被沉淀富集，会对底栖生物产生较大的影响。有研究表明，生物组织中标志物活性（含量）与环境中污染物含量呈一定相关性，因此，研究东海海域沉积物中污染物的含量变化，能够为筛选生物标志物提供基础数据，同时有利于初步掌握不同区域的污染特征和来源，对于应用生物标志物法评价周围人类活动对海域环境的生态压力有重要作用。

毛蚶(Scapharcasubcrenata)俗称毛蛤、麻蚶、瓦楞子，属于软体动物门、瓣鳃纲、翼形亚纲、蚶目、蚶科、毛蚶属，广泛分布于日本、朝鲜、中国沿岸;在中国北起鸭绿江，南至广西均有分布，以莱州湾、渤海湾、辽东湾、海州湾等浅水区的资源尤为丰富。近年来，随着工农业的迅猛发展，近海遭到不同程度的污染，特别是石油工业和海上交通运输业的发展，使得石油成为近海中最主要的污染物，石油污染不仅能使鱼、虾、贝类海产品变味，严重时能产生毒性效应，给海洋生态环境和渔业资源带了严重危害；同时，由于重金属易在底质中蓄积，不易降解，往往被生物富集，对人体健康具有潜在的威胁，重金属污染也是当今世界普遍关注的环境问题之一，特别是1931年日本发生镉中毒以来，镉污染越来越受到人们的重视。

金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类富含半胱氨酸(Cys)的低分子量蛋白质，常含有Cys-Cys、Cys-Xn-Cys等结构，其Cys残基中的巯基(SH)能够螯合金属离子，通过降低其它功能蛋白关键靶位的金属浓度，减轻金属的毒性作用。研究发现，MT可被重金属、氧化损伤和免疫刺激等多种环境因素诱导产生，且受到重金属暴露时，机体内重金属含量与MT表达水平之间存在着显著相关性。目前，MT已被联合国环境规划署遴选为海洋环境监测的生物标志物之一(UNEP/RAMOGE)。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种通过基因克隆技术克隆毛蚶金属硫蛋白酶的基因核心片段获得的毛蚶金属硫蛋白酶，其在毛蚶的血细胞和腮中毛蚶金属硫蛋白酶基因的相对表达量最高，克隆用PCR反应体系能保证扩增反应的特异性、提高PCR扩增效率。

本发明的目的之二在于提供一种利用毛蚶金属硫蛋白酶用作新型海洋生物污染检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。

本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：

毛蚶金属硫蛋白酶基因，毛蚶金属硫蛋白酶基因为克隆基因；毛蚶金属硫蛋白酶基因通过基因克隆技术克隆获得。

作为优选，毛蚶金属硫蛋白酶基因的克隆具体步骤为：

总RNA提取：以毛蚶作为材料，提取各组织总RNA；

cDNA第一链的合成：以获得的总RNA样品作为模板，使用M-MLV反转录试剂盒进行cDNA的反转录合成，获得cDNA第一链；