[发明专利]J亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法和应用

说明书

本发明公开了一种J亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法和应用，包括下列步骤：（1）设计并合成扩增gp85基因的特异性引物（2）PCR扩增获得gp85基因片段并纯化；（3）将gp85基因克隆至pET‑32a原核表达载体，筛选阳性克隆后测序鉴定；（4）重组表达载体pET‑32a‑gp85的表达；（5）尿素法纯化表达的gp85蛋白；（6）重组gp85蛋白的复性。利用本发明的方法获得了高纯度的可溶性gp85蛋白。表达的蛋白可作为包被抗原建立抗体检测方法，还可用于免疫动物制备抗血清，为免疫荧光、免疫组化、胶体金检测卡制备等提供原材料。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种J亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法和应用。

背景技术

1991年，自英国科学家Payne首次报道J亚群禽白血病病毒（avian leukosisvirus subgroup J, ALV-J）后，在世界各大洲的肉种鸡群中全面爆发该病，尤其是1997和1998年使世界养禽业遭受了毁灭性打击。由于ALV-J在养鸡业的广泛流行、我国养殖模式的多样化、规模参差不齐等特点，进行ALV-J的净化还是一项巨大的挑战。目前无有效的疫苗和药物进行该病的防治，临床上主要靠ELISA抗原/抗体试剂盒检测后剔除阳性鸡来控制感染。现在开展血清学监测通常使用美国等公司的检测试剂盒，检测成本高、推广范围窄。根据国外毒株研制的检测方法和试剂盒不能准确检测到国内鸡群的感染状况，因此建立快速检测ALV-J的方法对国内ALV-J的净化尤为重要。ALV-J的env基因编码病毒囊膜糖基化蛋白，包括膜表面糖蛋白亚单位gp85和跨膜糖蛋白亚单位gp37。gp85蛋白是病毒的主要抗原，病毒中和反应的作用位点，含有病毒-受体决定簇，主要起病毒粘附易感动物细胞的作用，同时也能诱导有免疫力的鸡群产生特异性抗体。如何将ALV-J的重组gp85蛋白进行原核表达并纯化得到纯度高可溶性好的gp85蛋白，是本发明要解决的技术问题。

发明内容

本发明就是针对上述存在的缺陷而提供一种J亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法。本发明将ALV-J分离毒株的重组gp85蛋白进行原核表达并利用尿素法纯化得到包涵体蛋白，通过透析复性得到了纯度高可溶性好的gp85蛋白。表达的蛋白可作为包被抗原建立抗体检测方法，还可用于免疫动物制备抗血清，为免疫荧光、免疫组化、胶体金检测卡制备等提供原材料。同时，利用单克隆抗体技术制备抗蛋白的单克隆抗体，为今后对该病毒的临床诊断和抗原检测试剂盒的开发提供物质基础。

本发明的J亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白及其纯化方法技术方案为，

一种J亚群禽白血病病毒gp85基因重组原核表达蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

（1）设计扩增gp85基因的特异性引物：

ALV-J-F：5’- CG GGATCC GGAGTTCATCTGTTGCAACAACCAG-3’（加粗代表保护碱基，斜体为BamHⅠ酶切位点）

ALV-J-R：5’- CCC AAGCTT TTA GCGCCTGCTACGGCGGTGAC-3’（加粗代表保护碱基，斜体为HindⅢ酶切位点，下划线为终止密码子）；

（2）PCR扩增获得gp85基因片段并纯化；

（3）将gp85基因克隆至pET-32a原核表达载体，筛选阳性克隆后测序鉴定；

（4）重组表达载体pET-32a-gp85的表达；

（5）尿素法纯化表达的gp85蛋白；

（6）重组gp85蛋白的复性。