[发明专利]用于定量检测乙型肝炎病毒的微滴数字PCR试剂盒及检测方法

说明书

本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种用于定量检测乙肝病毒的微滴数字PCR试剂盒及检测方法。本发明的微滴数字PCR试剂盒包括微滴数字PCR检测试剂，包括由SEQ ID NO:1所示的正向引物、由SEQ ID NO:2所示的反向引物、由SEQ ID NO:3所示的探针；探针的两端标记有荧光基团。本发明微滴数字PCR试剂盒的特异性好、灵敏度高、能快速检测到极低含量的病毒，而且可直接定量，无需标准曲线。技术操作简便、自动化程度高，为低浓度乙肝病毒检测和定量提供了一种切实可行的方法。

技术领域

本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种用于定量检测乙肝病毒的微滴数字PCR试剂盒及检测方法。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus)属嗜肝DNA病毒科(hepadnaviridae)，基因组长约3.2kb，为部分双链环状DNA。乙型肝炎病毒复制的特点是：肝细胞核内有稳定的共价闭合环状DNA(cccDNA)存在；有一个逆转录步骤。乙型肝炎病毒基因组中已确定的开放读框有4个，分别编码病毒的核壳(C)和包膜(S)蛋白，病毒复制酶(聚合酶)及一种似乎与病毒基因表达有关的蛋白质X。乙肝病毒具有传染性强、传播途径复杂、感染过程多样化、流行面广泛、发病率高、治疗困难等特点。由其引起的乙型病毒性肝炎广泛流行于世界各国，主要侵犯儿童及青壮年。人体感染乙肝病毒后常可导致急、慢性乙型病毒性肝炎，长期的慢性感染可发展成肝硬化、甚至肝细胞癌，是一种潜在的严重威协人类健康的传染病。因此要求对乙型肝炎病毒感染尽快针对不同病情给以恰当的治疗。快速灵敏的乙型肝炎病毒检测是及时诊断及治疗的必要条件

数字PCR(Digital PCR-dPCR)技术是最新的核酸检测及定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种绝对定量的方法。其基本原理是，将适度稀释的低浓度核酸样本分装进若干个独立的微反应体系中，由于稀释后靶核酸分子浓度极低，使有些微反应体系中无靶核酸分子，有些微反应体系中含有至少1个靶核酸分子。经过PCR扩增，无靶核酸分子的微反应呈阴性，有靶核酸分子的微反应呈阳性。计数阳性微反应的数量，再结合泊松分布概率密度函数，可得到每个微反应体系中靶核酸分子的平均含量，进而获得样品中靶核酸分子的原始浓度。

数字PCR在进行结果判读时仅判断有/无两种扩增状态，完全不依赖于Ct值，受扩增效率的影响大大降低，对PCR反应抑制物的耐受能力大大提高；另外，数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数。相比于传统的荧光PCR，拥有更加出色的灵敏度、特异性和精确性，其在极微量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异分析方面展现出的优势已被普遍认可。

为了应对临床上日益增长的乙型肝炎病毒检测高灵敏度和高准确性检测的需求，开发基于dPCR的乙型肝炎病毒检测方法，具有十分重要的意义。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的发明目的在于提出一种用于定量检测乙肝病毒核酸的数字PCR试剂盒及检测方法。

本发明的又一发明目的在于提出一种采用数字PCR检测乙肝病毒核酸的引物和探针。

为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种用于定量检测乙型肝炎病毒的微滴数字PCR试剂盒，所述微滴数字PCR试剂盒包括微滴数字PCR检测试剂，所述微滴数字PCR检测试剂中含有用于检测乙型肝炎病毒核酸的引物和探针；所述用于检测乙型肝炎核酸的引物和探针包括由SEQ ID NO:1所示的正向引物、由SEQ ID NO:2所示的反向引物、由SEQ ID NO:3所示的探针；所述探针的两端标记有荧光基团。

可选的，所述探针的5’端标记有FAM，3’端标记有BHQ。