[发明专利]一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量PCR试剂盒

说明书

本发明涉及一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括PCR反应液、酶混合液、产气肠杆菌Cad基因标准品、阴性对照品和阳性对照品。本发明通过提取产气肠杆菌的基因组DNA，结合实时荧光定量PCR检测技术，可达到准确定量待测标本中产气肠杆菌含量的目的，具有快速、灵敏、特异性好的特点，对判断产气肠杆菌活性菌的含量以及后续研究泌尿道感染具有重要意义。

技术领域

本发明涉及分子生物学和微生物检测技术领域，尤其涉及一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

产气肠杆菌（Enterobacter aerogenes，EAE）属于肠杆菌科肠杆菌属，为革兰氏阴性兼性厌氧杆菌，是一种条件致病菌。当宿主机体状态改变或细菌进入肠道以外的部位，可引起呼吸道、泌尿生殖道、血液等感染，也是老年人感染或院内获得性肺炎的常见致病菌。产气肠杆菌可以产生B一内酰胺酶，多年来由于抗生素的滥用，该类细菌引起医院感染的概率不断上升，已成为院内感染常见的条件致病菌。

传统的诊断产气肠杆菌的方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类，需要大量的时间进行生理生化反应的结果判定，不利于及时找到病原，诊断病因。PCR技术作为一种分子生物学工具，可以选择性体外扩增DNA或RNA片段，操作简单、特异性强、快速、敏感性高等特点。Taq Man FAM探针法检测特异性强，灵敏度高，方便优化反应条件，能够用于产气肠杆菌的快速检测。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏、特异性好的用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量PCR试剂盒。

为解决上述问题，本发明所述的一种用于产气肠杆菌检测的实时荧光定量PCR试剂盒，包括

—PCR反应液，由12mM Tris-HCl（pH8.9）、100mM KCl、0.12%Triton X-100、0.12%胆酸钠、0.6 mg/mL BSA、1.8mM MgCl₂、50nM dNTP、500nM上游引物、500nM下游引物、300nMTaqman探针组成；

其中上游引物序列为5'-CGCTGTACGCTTCATCTATT-3'；下游引物序列为5'-GACGCTGTATGCCGAGGTT-3'；探针序列为5’-TTCCCTTTGCCTAACATATCTACCGTTT-3’；

—酶混合液，由5U/µL Taq DNA聚合酶，50%甘油，20mM Tris-HCl (pH8.0, 25℃)，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5% Tween^®20和0.5% NP-40组成；

—产气肠杆菌Cad基因标准品，由1.00×10⁸copies/ml、1.00×10⁷copies/ml、1.00×10⁶copies/ml、1.00×10⁵copies/ml的重组质粒组成；

其中Cad基因标准品序列为5’-CGCTGTACGCTTCATCTATTTTCCCTTTGCCTAACATATCTACCGTTTTTATCTGGTAGAAAATCGCCATATCTTTAATGCCGGGCATTTTACCTACTTTTTCAACCTCGGCATACAGCGTC-3’；

—阴性对照品，由水组成；

—阳性对照品，由1.00×10⁷copies/ml的重组质粒组成。

所述上游引物和所述下游引物为包括引物序列的互补链序列。

所述上游引物和所述下游引物为向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。