[发明专利]用于定量检测EB病毒核酸的数字PCR试剂盒及检测方法

说明书

本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种用于定量检测EB病毒核酸的数字PCR试剂盒及检测方法。本发明试剂盒含有数字PCR反应液和质控品；数字PCR反应液中含有用于检测EB病毒核酸的引物和探针，包括由SEQ ID NO:1所示的正向引物、由SEQ ID NO:2所示的反向引物、由SEQ ID NO:3所示的探针；探针的两端标记有荧光基团。本发明的试剂盒及检测方法可实现对核酸分子的绝对定量，从而避免了由PCR扩增效率差异所导致的偏差，具有更高的精确度、灵敏性和重复性，易于标准化。

技术领域

本发明属于病毒核酸检测领域，具体涉及一种用于定量检测EB病毒核酸的数字PCR试剂盒及检测方法。

背景技术

人类是EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)惟一天然宿主，EB病毒的全世界人感染率超过90％。原发感染通常发生在幼年时期，并且无症状，表现为隐性感染；但如果感染发生在青少年或成年，则可能导致感染性单核细胞增多症。据报道，我国95％以上人群在3～5岁时已感染了EBV。原发感染后，病毒可以长期持续性存在，呈潜伏感染状态，在大多数病例中无症状。EB病毒主要经唾液传播，但也有报道经血液和性活动传播。EB病毒感染细胞有两种形式：即潜伏性感染和增殖性感染。在潜伏性感染中，病毒以环状游离体和/或整合型形式存在。在一定条件下，如免疫功能低下或某些物理化学因素的作用(紫外线、丁酸、巴豆油及尿嘧啶等)，EB病毒可以从潜伏状态变为增殖状态。

我国是鼻咽癌的高发国家，其发病率占头颈部肿瘤的首位。已有大量的实验研究表明，EB病毒与鼻咽癌关联密切，放疗前血浆EBVDNA检测对NPC的临床分期和判断预后有重要的临床意义，放疗结束时血浆EBV DNA检测对残留病灶和总生存判断同样具有重要意义，并对放疗后肿瘤转移复发有监测作用。传统的EB病毒相关抗体的检测是诊断及监测患者病情最常用的方法，但是它的敏感性和特异性较差。目前的荧光定量PCR对原有核酸只能进行相对定量,需要依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，且对病毒是否为阳性的检测存在不确定的检测结果，导致多次检测，或者检测结果不准确。ddPCR技术的引入为直接和真实地反映患者体内病毒复制水平，为我们在肿瘤的诊断、治疗和判断预后方面提供了一种新的非侵入性手段。

数字PCR技术是近年兴起的第三代PCR绝对定量技术，与实时荧光定量PCR技术相比，数字PCR不依赖于扩增曲线的阈值(C_T)进行定量，不受扩增效率的影响，也不必采用标准曲线，具有很好的准确度和重现性，可以实现绝对定量分析。在现阶段的低丰度因子检测中，实时荧光定量PCR技术都因受到背景DNA或杂质的干扰，使得检测灵敏度及精确性都达不到精准定量的要求，而数字PCR检测系统通过微滴化处理，使得稀有检测片段从大量的复杂背景中分离出来，从而提高检测的灵敏度和精确性。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的发明目的在于提出一种用于定量检测EB病毒核酸的数字PCR试剂盒及检测方法。

本发明的又一发明目的在于提出一种采用数字PCR检测EB病毒核酸的引物和探针。

为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种用于定量检测EB病毒核酸的数字PCR试剂盒，所述试剂盒含有数字PCR反应液和质控品；所述数字PCR反应液中含有用于检测EB病毒核酸的引物和探针，所述用于检测EB病毒核酸的引物和探针包括由SEQ ID NO:1所示的正向引物、由SEQ ID NO:2所示的反向引物、由SEQ ID NO:3所示的探针；所述探针的两端标记有荧光基团。

可选的，SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ。

可选的，所述数字PCR反应液中还含有数字PCR缓冲液。