[发明专利]一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法

权利要求书

1.一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法，其特征在于：包括如下步骤：

步骤一：Genbank中搜索获得嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因，按照毕赤酵母对遗传密码子的喜好性对嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因进行密码子优化；

步骤二：按照定点突变PCR的要求，分别设计三对引物；分别为:

A1:GTTGCCAGAATTGAAGCAAGGTGGTAGAATCCA；

A2:TGGATTCTACCACCTTGCTTCAATTCTGGCAAC；

B1:TCGAAAGATTGAAGCAATCCCCAGTTTGGAC；

B2:GTCCAAACTGGGGATTGCTTCAATCTTTCGA；

C1:TGAACGGTCCAAAGCAAGGTTCTTCTGATAG；

C2:CTATCAGAAGAACCTTGCTTTGGACCGTTCA；

交由IDT进行引物合成；

步骤三：以A1和A2为引物，进行PCR反应定点突变R103Q，以B1和B2为引物，进行PCR反应定点突变R230Q，再以C1和C2为引物，进行PCR反应定点突变R330Q；

步骤四：对三轮Kex2定点突变后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因进行测序，测序结果显示通过定点突变PCR后的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因序列与预先设计的序列一致；

步骤五：将合成的野生型或Kex2定点突变的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因与毕赤酵母表达质粒分别进行酶切，胶回收酶切片段，T4连接酶连接两者后转化大肠杆菌，获得含有启动子-α因子信号肽-嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽基因的表达质粒的菌株，挑克隆提取质粒后测序；

步骤六：提取上述菌株中经测序鉴定的质粒，酶切线性化后电转化pep4/prb1双蛋白酶缺陷型巴斯德毕赤酵母感受态细胞，转化后的细胞涂布于带有不同浓度的zeocin抗性的YPD平板，挑克隆，对克隆进行小量发酵培养，检测酶活力，以获得新型高效的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因的毕赤酵母工程菌。

2.根据权利要求1所述的一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法，其特征在于：成熟肽序列中3个潜在的丝氨酸蛋白酶识别位点Kex2被改变为其它氨基酸残基并按毕赤酵母偏爱密码子设计的嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因。

3.根据权利要求1所述的一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法，其特征在于：表达载体为含有高效甲醇诱导启动子AOX1或非甲醇依赖性的组成型启动子GAP的质粒。

4.根据权利要求1所述的一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法，其特征在于：步骤一中由GenScript对优化过的基因进行合成，合成的基因序列由Macrogen进行测序，测序结果与预先设计的基因序列一致。

5.根据权利要求1所述的一种嗜热脂肪土芽孢脂肪酶基因分泌表达方法，其特征在于：步骤三中氨基酸编号以嗜热脂肪土芽孢脂肪酶成熟肽的第一个氨基酸为1。