[发明专利]生物活性肽kss1b及其制备方法与应用

说明书

本发明属于多肽制备技术领域，具体公开了生物活性肽kss1b及其制备方法与应用。本发明通过选择合适的表达菌株以及合适的载体，并采用自动诱导的方式，提供了一种较为理想的利用大肠杆菌来进行kss1b的重组表达方案。使用该方法能够稳定获得1mg/L的高纯度的重组kss1b(rkss1b)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。rkss1b能够在1μM水平，显著抑制大鼠DRG细胞上的TTX‑S型电压敏感钠通道(VGSC)电流。

技术领域

本发明属于多肽制备技术领域，具体地说，涉及生物活性肽kss1b及其制备方法与应用。

背景技术

中药蜈蚣是使用蜈蚣科动物少棘巨蜈蚣的全体，其入药的主要活性组分为蜈蚣毒素。该蜈蚣毒素有较高的药用价值，具有攻毒散结、熄风镇痛、抗癌等功能，其药用价值被国内外医学专家高度重视。蜈蚣毒素中有相当多的多肽小分子，具有不同的生理活性，是潜在的药用分子，但是相较蝎子毒素，我国对于单一的源自蜈蚣的活性多肽分子的活性研究较少。

kss1b是从少棘蜈蚣的cDNA文库中获得的毒素，它与钾通道抑制剂kss1a同源，由50个氨基酸残基构成，含有3对二硫键的多肽分子，推测其可抑制大鼠背神经节中的钾通道电流，可能是一种潜在的神经多肽药物。此外，可通过对比kss1b与kss1a的活性与氨基酸序列，来对作用钾通道的关键氨基酸残基进行分析确定，从而开发获取更高效专一的钾通道调节剂，使得开发更有效的神经多肽药物成为可能。同时，通过kss1b毒素多肽的制备获得，可进一步探究kss1b与kss1a的活性关联，从进化学角度来对蜈蚣毒素有更加深层次的认识。为了更好的研究和开发蜈蚣毒素，使其直接成药或者作为药物先导分子开发，势必需要制备一批高纯度的kss1b多肽以供研究。

kss1b对应的氨基酸序列为：ANDKPIGKCGDAKRNKPCLACSHRSSIADFYSKCCTYDAVYNGCLDKLRH(SEQ ID NO.11)。获取kss1b一般通过化学合成或者利用微生物进行异源表达。根据发明人多年的多肽制备经验，氨基酸长度在30个以上，同时含有多对二硫键的小分子多肽，如果采用化学合成的路线，因需要反复的变复性(形成二硫键)和纯化，导致其成本相当昂贵；利用微生物进行重组表达则成本相对低廉很多。而通过微生物获取工业级别的大量重组多肽，只能是通过大肠杆菌或者毕赤酵母。但是使用毕赤酵母，存在产物均一化程度不高的问题，而且相对大肠杆菌制备，有更高的技术门槛。目前还没有使用大肠杆菌来制备kss1b的报道，对其活性更加无从谈起。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供生物活性肽kss1b及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种生物活性肽kss1b，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

本发明通过通过全细胞膜片钳实验研究发现，SEQ ID NO.11所示的生物活性肽kss1b，能够在1μM水平下，显著抑制大鼠DRG细胞上的TTX-S型电压敏感钠通道(VGSC)电流。

第二方面，本发明提供了所述生物活性肽kss1b的制备方法，具体为：通过构建生物活性肽kss1b的表达载体，将其转入大肠杆菌中，诱导表达含有kss1b的融合蛋白，提取后经处理获得生物活性肽kss1b，纯化即得。

作为优选，所述大肠杆菌采用SHuffle^TM，该菌株作为表达菌株，能提供其他大肠杆菌无法提供的胞内氧化环境，使得含有三对二硫键的kss1b能够正确形成二硫键，获得正确折叠的kss1b。

作为优选，本发明所述生物活性肽kss1b的表达载体包括如下自上游至下游的片段：编码6×His的序列、编码SUMO的序列、编码生物活性肽kss1b的序列；其中，编码6×His的序列如SEQ ID NO.1所示，编码SUMO的序列如SEQ ID NO.2所示，编码生物活性肽kss1b的序列如SEQ ID NO.3所示。