[发明专利]Ae1d活性肽及其制备方法与应用

说明书

本发明属于多肽制备技术领域，具体公开了Ae1d活性肽及其制备方法与应用。本发明通过选择合适的表达菌株以及合适的载体，并采用自动诱导的方式，提供了一种较为理想的利用大肠杆菌来进行Ae1d的重组表达方案。使用该方法能够稳定获得0.55mg/L的高纯度的重组Ae1d(rAe1d)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。rAe1d能够在0.5μM水平，显著抑制大鼠DRG细胞上的电压敏感钾通道(VGPC)电流。

技术领域

本发明属于多肽制备技术领域，具体地说，涉及Ae1d活性肽及 其制备方法与应用。

背景技术

相较小分子药物，多肽药物具有更好的选择性，体内无结存等特 点，越来越受到各大制药公司的青睐。蚂蚁，作为与恐龙一样古老的 物种，《本草纲目》中记载有蚂蚁用于治疗疾病的用法,在辞书《尔 雅》中也有详细的叙述。蚂蚁拥有很高的药用价值,被称为微型动物 营养宝库和天然药物加工厂,既能健身又能治病,很适合作为一种新 的药用资源开发利用。但是目前对蚂蚁的开发，仅仅局限于整体入药， 还未深入研究其单一组分的生物活性。如果能明确蚂蚁单一高活性组 分，剥离其他无关或有副作用的组分，即可明显提高其药效。

随着目前高通量测序和分子生物学技术的发展，蚂蚁毒腺中的 cDNA分子已经解析得越来越多，通过异源表达这些cDNA分子，即 可分析其生理活性。基因Ae1d是从蚂蚁Anochetus emarginatus粗毒中 获得的一类功能未知的多肽分子，它与钙通道抑制剂Ae1a具有一定同 源，均为由18个氨基酸残基构成，含有两对二硫键的多肽分子。Ae1d 与钙通道抑制剂Ae1a同源度分别为62.5％，同源性较高且二硫键的位 置相同，因此推测其与Ae1a可能存在有类似的空间结构和相似的生理 活性，即可抑制大鼠背神经节中的钙通道电流，可能是一种潜在的神 经药物。此外，可通过对比Ae1d与Ae1a的活性与氨基酸序列，来对 作用钙通道的关键氨基酸残基进行分析确定，从而开发获取更高效专 一的钾通道调节剂，使得开发更有效的神经多肽药物成为可能。同时， 通过Ae1d毒素多肽的制备获得，我们可探究Ae1d与Ae1a以及其相互 间的相互作用活性。为了更好的研究和开发利用蚂蚁毒素，使其直接 成药或者作为药物先导分子开发，势必需要制备一批高纯度Ae1d多肽 以供研究。

Ae1d对应的氨基酸序列为：RSLCSNGCRPKPFGGCSC(SEQ ID NO.11)。根据发明人多年的多肽制备经验，如果想通过微生物获取工 业级别的大量重组多肽Ae1d，只能是通过大肠杆菌或者毕赤酵母。但 是使用毕赤酵母，存在产物均一化程度不高的问题，而且相对大肠杆 菌制备，有更高的技术门槛。目前还没有使用大肠杆菌来制备Ae1d 的报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供Ae1d活性 肽及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种Ae1d活性肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

本发明通过通过全细胞膜片钳实验研究发现，SEQ ID NO.11所示 的Ae1d活性肽，能够在0.5μM水平下，显著抑制大鼠DRG细胞上的 电压敏感钾通道(VGPC)电流。

第二方面，本发明提供了所述述Ae1d活性肽的制备方法，具体 为：通过构建Ae1d活性肽的表达载体，将其转入大肠杆菌中，诱导表 达含有Ae1d的融合蛋白，提取后经处理获得Ae1d活性肽，纯化即得。

作为优选，所述大肠杆菌采用SHuffle^TM，该菌株作为表达菌株， 能提供其他大肠杆菌无法提供的胞内氧化环境，使得含有三对二硫键 的Ae1d能够正确形成二硫键，获得正确折叠的Ae1d。