[发明专利]一种大豆HRM-SNP分子标记点标记方法及其应用

权利要求书

1.一种大豆HRM-SNP分子标记点标记方法，其特征在于，所述大豆HRM-SNP分子标记点标记方法包括：

大豆SNP标记的开发：使用数据库中的Genome浏览器工具从Williams 82物理图谱中每10Mb选择一个SNP标记，每条染色体选择4～6个SNP，均匀分布于大豆基因组20条染色体上，获取每个SNP标记的详细信息，包括dbSNP名称，SNP位置，SNP等位基因以及上下游121bp基因组序列；

所述SNP标记筛选如下：

所述dbSNP名称和SNP标记的PCR引物序列为：

大豆基因组DNA提取:根据改进的CTAB法提取大豆幼嫩叶片的基因组DNA，并稀释至25ng·μL^-1，保存于-20℃冰箱以备后续HRM分析使用；

高分辨率熔解曲线过程与分析：在定量PCR仪上利用SNP标记的PCR引物进行PCR扩增和HRM分析；高分辨率熔解曲线分析采用480软件的Gene Scanning模块进行，获得更好的标准化熔解曲线；

大豆基于HRM技术的SNP分型：大豆DNA在定量PCR仪内进行扩增和HRM分析；

大豆HRM分型验证：随机对部分SNP标记的PCR产物进行Sanger测序，验证HRM分析的准确性；

大豆SNP指纹图谱的构建：以Williams 82为对照，利用开发的101个SNP标记对菜用大豆进行HRM分型，并将分型结果按照染色体编号－物理图距从小到大的顺序依次列出；

大豆基因组DNA提取中，大豆为浙鲜九号，根据改进的CTAB法提取浙鲜九号幼嫩叶片的基因组DNA，并稀释至25ng·μL^-1，保存于-20℃冰箱以备后续HRM分析使用，具体步骤包括：

(1)提取缓冲液2％CTAB，100mmol·L^-1Tris-HCL，pH8.0；20mmol·L^-1EDTA；2％PVP；1.4mol·L^-1Nacl，使用前加入0.2％的巯基乙醇，预热至65℃；

(2)取新鲜叶片0.05g，适当剪碎后放入2.0ml离心管中，加入1颗直径5mm钢珠，2～3颗2mm小钢珠；

(3)在含样品和钢珠的离心管中加入1.0mL预热的提取缓冲液，盖好离心管盖，装入适配器后在TissueLyser-192磨样机中研磨60秒；

(4)取出离心管，65℃水浴10-30min，然后取出离心管，1200rpm离心5-10min；

(5)取1mL上清液到新的2mL离心管中，加入700μL按体积比酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1，缓慢颠倒混匀数次；室温，1200rpm离心5-10min；

(6)取800μL上清液到新的2mL离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇＝24:1，缓慢颠倒混匀数次；室温，1200rpm离心5-10min；

(7)取600μL上清液到新的1.5mL离心管中；加入400μL预冷的异丙醇，缓慢颠倒混匀，置于-20℃冰箱放置30min；

(8)室温，1200rpm离心10min，弃上清；

(9)加入1mL预冷的70％乙醇洗涤DNA，1200rpm离心10min，弃上清；

(10)DNA放入超净工作台吹干，加入100-200μL去离子水溶解DNA；

(11)加21μL 0mg/mL RNase 37℃水浴30min；

(12)取5μL DNA，以1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，以及UVS-99微量核酸检测仪检测DNA浓度及质量；

高分辨率熔解曲线过程与分析中，

20μL反应体系的组合为：2μL DNA50ng，4μL 5x EVAGreen Realtime PCR Mix，10μmol·L^-1的上、下游引物各0.4μL，其余用水补足；混合体系放置于96孔PCR板内，贴上封板膜瞬时离心，置于仪器内反应；

反应程序是：95℃预变性15min，经过45个常规循环，接着高分辨率熔解，最后产物冷却至40℃保持10s；

循环程序是95℃15s，60℃20s，72℃20s，共45个循环；

高分辨率熔解过程是：95℃1min，40℃1min，65℃1s，65-95℃读取熔解曲线，温度分辨率0.02℃，以每摄氏度25次的速率连续采集荧光信息；

浙鲜九号的SNP图谱为SEQ ID NO：1：“TCAACT AGCCA CTGCT CCTAG ATGAC CGCGATGGGG TGGGC CACCA TCACT TCTT CTGGT TACCA TACCG TGGCG AGGTC TAAAC GATCTC CTCTGCTACT”。

2.如权利要求1所述的大豆HRM-SNP分子标记点标记方法，其特征在于，

大豆基于HRM技术的SNP分型结果通过熔融峰Melting Peaks、标准化的熔解曲线Normalized Melting Curves、标准化温度差异视图NormalizedTemp-ShiftedDifference Plots进行表示。