[发明专利]蟛蜞菊内酯在制备治疗肺癌产品中应用的研究方法在审
| 申请号： | 201810746471.5 | 申请日： | 2018-07-09 |
| 公开（公告）号： | CN108998415A | 公开（公告）日： | 2018-12-14 |
| 发明（设计）人： | 黄祥宏;赵成诚;张强刚 | 申请（专利权）人： | 道赛尔生物科技（武汉）有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/09 | 分类号： | C12N5/09;C12Q1/02 |
| 代理公司： | 北京天盾知识产权代理有限公司 11421 | 代理人： | 杨本官 |
| 地址： | 430000 湖北省武汉市东湖*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 蟛蜞菊内酯 制备治疗肺癌 非小细胞肺癌 凋亡 细胞培养 中药治疗 细胞增殖抑制率 研究 应用 抗肿瘤作用 转录 碘化丙啶 基因表达 机制研究 理论基础 染色检测 生物科技 细胞基因 细胞周期 检测 翻译 细胞 干预 | ||
1.蟛蜞菊内酯在制备治疗肺癌产品中应用的研究方法，其特征在于，包括以下步骤：
细胞培养的步骤：复苏A549细胞后，每2～4天继代培养一次；
CCK-8法检测细胞增殖抑制率的步骤：在孔板上接种生长期细胞，之后分别用10、20、30μmol/L蟛蜞菊内酯作用细胞12、24、36h，每孔加CCK-8孵育，之后采集各孔光密度值；
碘化丙啶及Annexin-PI染色检测细胞周期及凋亡的步骤：在孔板上接种生长期细胞后分为对照组和蟛蜞菊内酯组，对照组每孔添加新鲜培养液，蟛蜞菊内酯组每孔加含蟛蜞菊内酯的新鲜培养液，之后收集细胞，一部分样本乙醇固定过夜，RNase A水浴，PI孵育，流式检测周期；剩余样本结合缓冲液重悬，取悬液于流式管中，Annexin V-FITC和PI孵育后，流式检测凋亡；
RT-PCR及Western blot检测细胞基因转录及翻译的步骤：细胞接种、培养、分对照组和蟛蜞菊内酯组，对照组每孔添加新鲜培养液，蟛蜞菊内酯组每孔加含蟛蜞菊内酯的新鲜培养液，之后收集细胞，一部分样本提总RNA并反转录，cDNA扩增，95℃预变性3min，95℃变性7s，56℃退火延伸30s，45个循环，凝胶成像；剩余样本RIPA提取总蛋白，SDS-PAGE后，以p-Caspase3、p53、p-STAT1、STAT1、GAPDH为一抗，孵育过夜，室温孵育二抗，化学发光仪曝光条带。
2.根据权利要求1所述蟛蜞菊内酯在制备治疗肺癌产品中应用的研究方法，其特征在于，细胞培养的步骤中，A549细胞复苏后在含10％FBS的RPMI-1640培养基中培养。
3.根据权利要求1所述蟛蜞菊内酯在制备治疗肺癌产品中应用的研究方法，其特征在于，CCK-8法检测细胞增殖抑制率的步骤中以及，各孔光密度值在550nm波长处采集。
4.根据权利要求1所述蟛蜞菊内酯在制备治疗肺癌产品中应用的研究方法，其特征在于，碘化丙啶及Annexin-PI染色检测细胞周期及凋亡的步骤中以及RT-PCR及Western blot检测细胞基因转录及翻译的步骤中，蟛蜞菊内酯的终浓度为30μmol/L。
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