[发明专利]一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法

权利要求书

1.一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)黄曲霉孢子悬液的配制

将黄曲霉产毒菌株接种到高盐查氏斜面试管培养基上，于恒温培养基37℃培养72-96h，等待其孢子充分形成，加入4mL灭菌水，将试管内的黄曲霉孢子刮下，倒入装有灭菌水的三角瓶，并放入摇床振荡使孢子分散，将分散的孢子液用纱布过滤，制成黄曲霉孢子悬液，用血球计数板计数，把黄曲霉孢子悬液浓度调至10⁷cfu/mL；

(2)拮抗菌的初筛

将配好的黄曲霉孢子悬液迅速倒入冷却至45℃左右还未凝固装有的PDA培养基的三角瓶之中，摇匀使黄曲霉孢子悬液与PDA培养基混匀，再迅速将其倒入灭菌的平皿中，待其凝固，用接种环挑取待试菌落在制好的平板上用十字划线法划十字，并做一空白对照组，在恒温培养箱28℃下培养，72h后观察结果，选出具有拮抗作用的初筛的菌株；

(3)拮抗菌的复筛

将初筛的待试菌落在GAM液体培养基增菌24h，将菌液采用离心机离心两遍再用0.22μm无菌滤器滤掉菌体，把无菌上清液装在新的离心管中，用倾注平板法把1mL的无菌上清液迅速倒入未凝固的PDA培养基平板中，混匀，等其凝固用灭菌的2mm打孔器在平板中间打孔，将配好的黄曲霉孢子悬液用移液管向孔内注入25μL，以无菌空白培养基代替上清液做对照于恒温箱28℃培养72h左右，观察结果，选出有明显拮抗效果的菌株；

(4)拮抗菌的鉴定

常规鉴定：接种新鲜的菌株于LB平板上培养24h，观察菌落形态特征，若菌株菌落单一、形态正常，则立即取样进行革兰氏染色，并且于高倍显微镜下观察菌体形态；

生化鉴定：测定芽孢菌中常见的细菌生理生化指标；

分子鉴定：采用通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’进行菌株16S rDNA的PCR扩增，由上海生工生物公司合成的引物UP-1S：5’-ATTGGTGACACCGATCAAACA3-’和UP-2SR：5’-TCATACGTATGGATGTTATTC3-’3进行菌株gyrB基因的PCR扩增；PCR反应体系以黄曲霉拮抗菌株基因组DNA作为PCR扩增的模板，终浓度为50μL，PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，然后进行序列测定，再使用BLAST程序对16S rDNA和gyrB基因序列GenBank数据库中的gyrB基因进行比较，应用DNAstar以及mega7软件进行同源性分析以及发育树的建立。

2.根据权利要求1所述的一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，其特征在于，上述步骤(1)中，高盐察氏培养基由七水合硫酸镁1g、硝酸钠2g、氯化钾0.5g、磷酸二氢钾1g、硫酸亚铁0.01g、氯化钠60g、蔗糖30g、蒸馏水1000mL制成，121℃灭菌20min。

3.根据权利要求1所述的一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，其特征在于，上述步骤(2)中，PDA培养基由马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水1000mL制成，经过121℃灭菌20min。

4.根据权利要求1所述的一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，其特征在于，上述步骤(4)中，PCR反应体系为Taq PCR Master Mix PCR 25μL，Tem Plate DNA 4μL，PrimerF2μL，PrimerR 2μL，DDH2O 17μL。

5.根据权利要求1所述的一种筛选鉴定拮抗黄曲霉菌的菌株的方法，其特征在于，上述步骤(4)中，PCR反应的过程是94℃预变性4min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循环次数为33次，72℃再延伸10min，4℃保存30min。