[发明专利]一种标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的试剂盒及方法

说明书

本发明属于植物生物技术领域，涉及一种标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的试剂盒及方法。先提供一种标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的试剂盒，包括：花柱固定液试剂A，花柱洗涤液试剂B，微丝染料试剂C和胼胝质免疫荧光试剂D。再应用所述试剂盒标记微丝细胞骨架，步骤为：1)取授粉的花柱；2)用花柱固定液试剂A对花柱固定；3)用花柱洗涤液试剂B对花柱洗涤；4)用微丝染料试剂C和胼胝质免疫荧光试剂D的混合溶液对花柱染色；5)对花柱滴加抗荧光猝灭剂，在激光共聚焦显微镜下观察花柱中花粉管微丝细胞骨架。本发明所述试剂盒和方法实现了快速、灵敏、准确、简便地观察苹果花粉管内微丝骨架的结构与排列方式。

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，涉及一种标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的试剂盒及方法，特别涉及一种标记苹果自花、异花授粉后花柱中花粉管微丝细胞骨架形态的试剂盒及方法。

背景技术

植物的细胞骨架包括微丝和微管，它们组成不同的列阵，参与细胞分裂、生长和分化等众多的生理过程。不同真核生物细胞骨架的排列差异很大，花粉管细胞中的微丝骨架在生殖过程中承担着重要的角色。以往的研究主要集中在体外培养花粉管，并观察其细胞微丝骨架的形态；然而，能够清晰直观地观察田间自花和异花授粉后花柱中花粉管的微丝骨架排列，对了解花粉管通过细胞骨架参与信号转导、胞吞胞吐、极性生长过程及有性生殖有着重要的意义。由于授粉后的花柱中花粉管存在材料收集困难及木本植物细胞壁组成成分较为复杂的问题，因此对于苹果花柱中花粉管微丝骨架的研究更为困难。

本专利的研究以苹果授粉后，花柱中花粉管为试材，通过田间授粉、花柱固定、花柱中微丝骨架染色、花粉管内花粉管与花柱间胼胝质免疫荧光染色、激光共聚焦观察苹果自花和异花授粉后微丝骨架的排列方式。本专利为直观观察木本植物花粉管内微丝、微管的骨架结构与排列方式提供技术支持。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种标记苹果授粉后花柱中花粉管微丝细胞骨架的试剂盒，另一个目的是提供一种高效地标记苹果授粉后花柱中花粉管微丝细胞骨架的方法。

一种标记苹果授粉后花粉管微丝细胞骨架的试剂盒，包括：花柱固定液试剂A，花柱洗涤液试剂B，微丝染料试剂C和胼胝质免疫荧光试剂D；

所述花柱固定液试剂A包括：多聚甲醛、EGTA、PIPES、MgCl₂和蔗糖；

所述多聚甲醛的质量百分比为10％，EGTA的浓度配比为6mmol/L，PIPES的浓度配比为80mmol/L，MgCl₂的浓度配比为6mmol/L，蔗糖的质量百分比为18％；

所述花柱固定液试剂A的溶剂为双蒸水；

所述花柱洗涤液试剂B包括：Tris-HCl、NaCl和Tween；

每1L花柱洗涤液试剂B中包括：100mL的Tris-HCl、7g的NaCl和20mL的Tween，所述Tris-HCl的pH为7；

所述花柱洗涤液试剂B的溶剂为双蒸水；

所述微丝染料试剂C包括：NP-40、Alex-561-鬼笔环肽、Tris-HCl、NaCl和蔗糖；

所述NP-40的体积百分比为1％，所述Alex-561-鬼笔环肽浓度配比为200nmol/L，所述Tris-HCl的浓度配比为100mmol/L，所述Tris-HCl的pH为5.0，所述NaCl的浓度配比为300mmol/L，所述蔗糖的质量百分比为18％；

所述微丝染料试剂C的溶剂为双蒸水；

所述胼胝质免疫荧光试剂D包括：NP-40、纤维素酶、果胶酶Y-23、Tris-HCl、NaCl、甘氨酸、一抗anti-β-1,3-glucanase和二抗FITC-anti-mouse-lgG；