[发明专利]单链寡核苷酸的制备方法

权利要求书

1.一种单链寡核苷酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）设计模板3’-N’-X’-R’-N’-X’-5’，R’为能产生3’突出末端的耐高温限制性内切酶的识别位点，N’为切刻内切酶的识别位点，X’为目的单链X的互补序列；

（2）PEAR反应：模板经过高温变性、退火、延伸，得到延伸产物双链N’-X’-R’-N’-X’/N-X-R-N-X；利用能产生3’突出末端的耐高温限制性内切酶对双链进行切割，得到PEAR酶切产物N’-X’/N-X，该片段单链带有3’端突出的粘性末端；由于酶切不完全，没有被酶切的双链作为模板直接参与下一轮的扩增，而且模板在退火过程中通过滑动作用而继续延伸，串联重复序列增加，周而复始，实现目的产物的持续指数增长；

（3）切口引物延伸反应：对PEAR酶切产物进行纯化，切刻内切酶对PEAR酶切产物中的N-X链进行切割，产生单链缺口，另外一条单链保持完整，随后具有链置换活性的DNA聚合酶以缺口为起点进行延伸，切刻内切酶识别位点重新形成，使酶切-延伸的过程反复进行；同时通过置换下游的目的单链X，得到游离的单链X。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中能产生3’粘性末端的耐高温限制性内切酶为BsiHKAI，BsLI，KpnI，KpnI-HF，PstI-HF或者TspRI。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中切刻内切酶为Nt.BbvCI，Nt.BsmAI，Nt.BspQI，Nt.BstNBI，Nb.BvCI，Nb.BsmI，Nb.BsrDI或者Nb.BtsI。

4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）的PEAR延伸反应，模板的浓度为10 nM-1 μM，聚合酶为适用于PCR反应的耐热DNA聚合酶，其浓度为0.02-0.06 U/μL，循环数为10-30个，每个循环反应时间为3-10 min。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）的PEAR延伸反应，聚合酶为用于PCR反应的耐热DNA聚合酶，选自Phusion Hot Start Flex DNA聚合酶、OneTaq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Vent（exo-）DNA聚合酶或者Deep Vent（exo-）DNA聚合酶。

6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于，所述步骤（2）的限制性内切酶酶切反应，限制性内切酶的浓度为0.025-0.2 U/μL。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）的PEAR延伸反应，模板的浓度100 nM，聚合酶采用Vent（exo-）DNA聚合酶，其浓度为0.04 U/μL，循环数为30个，每个循环反应时间为5min；限制性内切酶酶切反应，限制性内切酶为TspRI，其浓度为0.04 U/μL。

8.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）切刻内切酶酶切反应，切刻内切酶的浓度为0.08-0.8 U/μL；反应时间为1-30min，温度为45-60℃。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）切口延伸反应，聚合酶为具有链置换活性的DNA聚合酶，选自Bst 2.0 DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Vent(exo-)DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Deep Vent(exo-)DNA聚合酶或者phi29 DNA聚合酶，其浓度为0.08-0.8 U/μL。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）切刻内切酶为Nt.BstNBI，其浓度为0.8 U/μL；反应时间为5min；温度为55℃；聚合酶为Bst 2.0 DNA聚合酶，其浓度为0.32 U/μL。