[发明专利]一种高产α-半乳糖苷酶的毕赤酵母菌株

说明书

本发明涉及一种毕赤酵母突变菌株，其保藏编号为CCTCC NO:M2018376。所述突变菌株能高效重组表达α‑半乳糖苷酶，其摇瓶发酵上清液中α‑半乳糖苷酶酶活高达109U/ml，比出发菌提高了137％；20L罐发酵上清液中α‑半乳糖苷酶酶活高达7576U/mL，比出发菌提高了69％，取得了意料不到的技术效果。而且，与出发菌相比，突变菌株毕赤酵母AG2重组表达的α‑半乳糖苷酶的酶学性质并未发生变化，最适作用pH均为3‑7，最适作用温度均为60℃。所述突变菌株毕赤酵母AG2可广泛应用于α‑半乳糖苷酶的生产。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株高产α-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌株及其应用。

背景技术

α-半乳糖苷酶(α-galactosidase)是催化α-半乳糖苷键水解的一种外切糖苷酶，因能分解蜜二糖，又称蜜二糖酶，它能催化α-半乳糖苷键的水解。α-半乳糖苷酶的催化作用是移除底物末端α－连接的非还原性D－半乳糖，或通过转糖基作用将半乳糖基团以α－1，6糖苷键转移到受体C6位的羟基上。含有这一类糖苷键的底物和受体在自然界中分布广泛，因此，α－半乳糖苷酶在工业、食品、医疗和科学研究中有着广泛的应用，被认为是最有应用潜力的酶制剂之一。

α-半乳糖苷酶广泛存在于植物、微生物及动物中，属于糖苷水解酶第26和37家族。其中，第26家族的α-半乳糖苷酶只来源于真核生物，而第37家族的α-半乳糖苷酶则主要来源于原核生物。根据酶活和最适pH，α-半乳糖苷酶有酸性和碱性之分。对于植物来源的α-半乳糖苷酶的研究比较多，在植物种子、果实、叶子和块茎中都发现了该酶，且来源于种子和叶子的多是酸性α-半乳糖苷酶，属于糖苷水解酶第37家族。碱性α-半乳糖苷酶多具有合成酶作用，且属于糖苷水解酶第26家族。

玉米-豆粕型饲料因具有粗蛋白质含量高、氨基酸含量平衡且富含赖氨酸等营养特点，是很好的蛋白质饲料来源。但豆粕及杂粕类饲料中α-半乳糖苷糖类含量相对较高，在饲料中是一种抗营养因子，简单的加工方法难以将其分解，且单胃动物不能分泌消化该类物质的酶，只有通过微生物发酵后才能利用寡聚糖，而产生的挥发性脂肪酸和各种气体均能使动物肠胃胀气、腹痛、腹泻、恶心和厌食等。另外，这些低聚糖还能刺激肠道蠕动、提高饲料通过消化道的速度、减少食糜在消化道停留的时间，从而影响营养物质的消化和吸收。α-半乳糖苷被认为是动物摄入饲料之后引起肠道腹胀的主要因素，因此，分解去除饲料中的抗营养因子α-半乳糖苷显得尤为重要。在饲料中添加外源α-半乳糖苷酶制剂，可专一性的催化水解α-1，6糖苷键，使α-半乳糖苷分解得到低聚寡糖和单糖。α-半乳糖苷酶可有效降解饲料中存在的α-半乳糖苷等抗营养因子，降低食糜黏度，减少幼龄动物腹泻发病率；增强动物的免疫功能和抗病能力，减少饲料中抗生素的用量；减轻或避免消化器官代偿性增生和肥大，降低动物维持需要量，提高饲料能量效价；扩大饲料配方中原料使用种类，降低养殖成本等。

目前，市售的α-半乳糖苷酶产品种类比较少，而且因生产菌株产量较低，导致该酶的价格居高不下，严重限制了该酶在饲料中的广泛应用。因此，开发高产α-半乳糖苷酶的生产菌株迫在眉睫。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种毕赤酵母突变菌株。所述毕赤酵母突变菌株是由构建得到的毕赤酵母工程菌经紫外诱变获得的，能大幅度提高α-半乳糖苷酶的表达量，且不影响重组α-半乳糖苷酶的酶学性质和应用效果。

本发明一方面提供了一种毕赤酵母工程菌株，所述菌株携带有用于重组表达α-半乳糖苷酶基因的重组质粒。

所述α-半乳糖苷酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ IDNO:2。

本发明一方面提供了一种毕赤酵母突变菌株毕赤酵母AG2(Pichia pastorisAG2)，已于2018年6月15日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018376。

本发明还提供了所述毕赤酵母突变株在生产α-半乳糖苷酶中的应用。