[发明专利]基于电场诱导释放检测技术结合靶标基因片段的转基因检测方法和试剂盒

权利要求书

1.基于EFIRM技术检测转基因大豆的试剂盒，其特征在于，包括以下探针组合：

检测CP4-EPSPS序列的组合1，由

第1捕获探针：5’-AGAGTCAGCTTGTCAGCGTGTCAAAAAAAA-3’，和

第1检测探针：5’- GCGCGCGTTAATTTGTGCCATTCTTGAAAGATCTGCT -3’组成，

所述CP4-EPSPS序列为：

5’-GACACGCTGACAAGCTGACTCTAGCAGATCTTTCAAGAATGGCACAAATTAAC-3’；

检测Lectin序列的组合2，由

第2捕获探针：5’-TTGAAGGAAGCGGCGAAGCTGG -3’，和

第2检测探针：5’-GTGTCAGGGGCATAGAAGGTGAAG-3’组成，

所述Lectin序列为：

5’-CCAGCTTCGCCGCTTCCTTCAACTTCACCTTCTATGCCCCTGACACAAAAAG-3’。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述检测探针3’端或5’端标记有用于结合催化酶的亲和物；所述亲和物为地高辛、异硫氰酸荧光素或生物素。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括催化酶，所述催化酶为带有标记物的辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述标记物为地高辛抗体、异硫氰酸荧光素抗体或链霉亲和素。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括对应所述催化酶的底物；

当所述催化酶为辣根过氧化物酶时，所述底物是TMB、ABTS和OPD中的任一种；

当所述催化酶为碱性磷酸酶时，所述底物是BCIP和NBT的组合物、对硝基苯磷酸盐、萘酚AS-BI磷酸盐、萘酚-AS-MX-磷酸盐中的任一种。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于将所述捕获探针固定至检测孔板上的反应孔中的固定物，所述固定物包括导电聚合物和离子化合物；

所述导电聚合物为吡咯、苯胺和噻吩中的任一种；

所述离子化合物为氯化钠或氯化钾。

6.根据权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于，还包括清洗液，所述清洗液包括洗液A和洗液B，所述洗液A是含SDS的SSC缓冲液，所述洗液B是含Tween20的PBS缓冲液。

7.一种基于EFIRM技术检测转基因大豆的检测孔板，其特征在于，所述检测孔板的反应孔底部设置有工作电极并配置为可施加电压以形成电场；

所述检测孔板的反应孔内分配并固定有以下核苷酸序列所示的捕获探针：

第1捕获探针：5’-AGAGTCAGCTTGTCAGCGTGTCAAAAAAAA-3’；

第2捕获探针：5’-TTGAAGGAAGCGGCGAAGCTGG -3’；

且一个反应孔仅固定一种捕获探针。

8.根据权利要求7所述的检测孔板，其特征在于：所述捕获探针是与导电聚合物和离子化合物混合成混合液后加到所述反应孔中，然后通过所述工作电极施加第一方波电场后固定在所述反应孔内底部表面；

所述第一方波电场的参数为：电压A：350mV，1s；电压B：950mV，1s；进行9个循环；

所述导电聚合物材料选自苯胺、噻吩和吡咯导电分子单体中的至少一种；

所述离子化合物选自氯化盐、硝酸盐、硫酸盐中的至少一种；

所述氯化盐为氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化铵中的一种，

所述硝酸盐为硝酸钠、硝酸钾、硝酸镁、硝酸铵中的一种，

所述硫酸盐为硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫酸铵中的一种。

9.一种基于EFIRM技术检测转基因大豆的方法，其特征在于，采用权利要求1-6任一所述的试剂盒，步骤如下：

（1）采用权利要求7-8任一所述的检测孔板；或将所述捕获探针加入到空白检测孔板中，所述反应孔内底部设置有电极，用于接通EFIRM检测仪后对反应孔内溶液施加电场进行聚合反应；接通EFIRM检测仪后对反应孔内溶液施加第一电场进行聚合反应；电场处理完毕，清洗检测孔板；所述第一电场处理的参数为：电压200-500mV，1-5s；电压800-1500mV，1-5s；3-10个循环；

（2）样本与捕获探针杂交

加入待测样本与杂交buffer的混合溶液，对反应孔施加第二电场：电压200-500mV，1-5s；电压300-800mV，1-5s；5-150个循环；清洗检测孔板；

（3）样本与检测探针杂交

加入与反应孔中的捕获探针对应的检测探针溶液，然后对反应孔施加第三电场：电压200-500mV，1-5s；电压300-800mV，1-5s；3-10个循环；清洗检测孔板，立即进行下一步操作；

所述检测探针溶液中检测探针的浓度为0.5-1.5μM；

（4）加入所述催化酶，孵育后清洗；

（5）加入底物，在电压为-100~-300mV的电场处理下读数，得到电流值，

（6）探针组1测得值与探针组2测得值的比值作为判断标准，当比值大于0.17时，判断为转基因样本；

当比值小于0.14时，判断为非转基因样本；

当比值在0.14和0.17之间时，需重新测定样本。