[发明专利]一种乳腺癌PDX构建方法

说明书

本发明公开了一种乳腺癌PDX构建方法，包括以下步骤：肿瘤组织样本的准备、免疫缺陷小鼠乳腺导管内注射接种以及免疫缺陷小鼠常规饲养与观察。本发明采用乳腺导管内注射的方法，可以将人源乳腺癌微组织块或乳腺癌原代细胞注射到免疫缺陷小鼠乳腺导管内，构建人乳腺癌原位PDX模型，更符合临床乳腺癌发生发展的实际，为人类更好的研究乳腺癌提供了便利。本方法也可以用于人源或者鼠源性细胞株乳腺导管内注射构建乳腺癌细胞株移植瘤模型。

技术领域

本发明涉及乳腺癌的治疗技术领域，尤其涉及一种乳腺癌PDX构建方法。

背景技术

人源肿瘤异种移植模型（Patient-derived xenografting, PDX）是指将肿瘤病人的新鲜肿瘤样本接种到免疫缺陷小鼠体内，肿瘤样本借助小鼠体内生理环境分裂增殖所构建的在体动物模型。PDX模型保留了肿瘤患者肿瘤的异质性、病理特征、基因表达与变异，与患者临床相关性高，因而有其他肿瘤模型所无法比拟的优势，对肿瘤个性化治疗、肿瘤科学研究和新药研发意义重大。但是，成功率低、周期长、成本高是阻碍PDX模型广泛使用的重要瓶颈。

乳腺癌是女性的常见肿瘤。现代研究认为，乳腺癌不是一种单一的疾病，而是作为以组织学，基因组改变，基因表达，转移行为和治疗反应多样性为特征的疾病异质性集合。除了患者群体之间（或单个患者的两种原发性肿瘤之间）的肿瘤异质性之外，最近的数据还显示出相当大的肿瘤内异质性（即在同一个患者单一肿瘤内的细胞之间以及原发肿瘤与其转移肿瘤之间的差异）。这对于有效治疗乳腺癌构成重大阻碍，开发一种基于个体的特定生物学和独特肿瘤的个性化治疗方法成为不二选的治疗策略。就基础研究和转化研究而言，乳腺癌内部和乳腺癌之间存在的异质性，也对乳腺疾病相关临床前模型的制作和使用提出了重大挑战。而PDX模型无疑是应对这一挑战的有利工具。

科研工作者试图通过直接用乳腺癌患者肿瘤组织接种到免疫功能低下的小鼠体内建立稳定的可移植的异种移植模型的努力已经持续了数十年。但是建立稳定的可移植模型（一般定义为小鼠PDX模型能够从P0代连续移植传代≧3代的能力）成功率只有10%左右。因此，很少有稳定的移植模型可以用于早期研究。近几年，随着免疫缺陷小鼠的更新迭代、接种方法的改进，人乳腺癌PDX模型的成功率稳定在了20%左右。

目前常用的乳腺癌接种方法很多，可以将乳腺癌组织或细胞接种到小鼠眼球前室、肾包膜下、肩胛脂肪垫，皮下（耳、面等）或原位的乳腺脂肪垫者注射到乳腺导管内。但上述接种位置均与临床上乳腺癌的生长环境有很大的差异，不符合乳腺癌发生发展的生理环境，因而应用受限。因为乳腺癌的激素依赖性，为了提高乳腺癌PDX的成功率，也有人选择给小鼠埋植雌二醇缓释片来促进小鼠成瘤。雌二醇缓释片价格高昂，大大增加了成本。

本发明创新性的采用乳腺导管内注射的方法建立乳腺癌原位PDX模型，能够将乳腺癌细胞或组织块接种至乳腺导管内，保留肿瘤微环境，更贴近临床实际情况，应用价值巨大。

发明内容

本发明为了解决现有技术的上述不足，提出了一种乳腺癌PDX构建方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：一种乳腺癌PDX构建方法，包括以下步骤：

1）肿瘤样本采集：手术中切取肿瘤边缘生长比较旺盛、无溃疡坏死的肿瘤组织，迅速装入含有组织保存液的离心管中，离心管装入冰包低温运输至实验室。

2）肿瘤样本处理：在实验室生物安全柜内用0.4%的台盼蓝染液检测肿瘤组织活性，剔除没有活性的组织。然后将组织放入0.2%的碘伏溶液中浸泡30秒钟消毒，再用含有3%双抗的PBS溶液冲洗组织。将冲洗干净的肿瘤组织放入新的培养皿中，一边用 7号针头戳组织，一边用少量 PBS溶液冲洗，把组织戳成片状后，再用两把镊子拧、挤压组织，并在 PBS溶液中漂洗，然后收集液体，通过 300 目过滤网过滤。将过滤后的微组织块悬液收集进15ml离心管，1000转/分钟离心5分钟，弃去离心管内大部分的液体，留取少量培养基悬浮微组织块备用。