[发明专利]基于棘球蚴微管蛋白为靶点的抗棘球蚴病高通量药物筛选方法

权利要求书

1.一种基于棘球蚴微管蛋白为靶点的抗棘球蚴病高通量药物筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）基因工程菌的构建和验证：以pET-28a+和pET-30a+原核表达质粒为载体，在强启动子T7的下游分别连接细粒棘球蚴和多房棘球蚴各14个α-微管蛋白同型基因Eg/EmTUA1~Eg/EmTUA14和11个β-微管蛋白同型基因Eg/EmTUB1~ Eg/EmTUB11，使重组表达的棘球蚴α-和β-微管蛋白的N端带上6个连续的组氨酸标签6×His，得到的蛋白表达基因工程菌的质粒载体分别为pET28a/pET30a-Eg/EmTUA1 ~ pET28a/pET30a-Eg/EmTUA14和pET28a/pET30a-Eg/EmTUB1 ~ pET-28a/pET30a-Eg/EmTUB11；

（2）重组微管蛋白的表达及纯化：将所述的蛋白表达基因工程菌的质粒载体通过热激法转化至感受态大肠杆菌BL21-DE3中，得到重组BL21-DE3细胞在LB培养基进行培养并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导表达，获得主要以包涵体形式存在的重组微管蛋白；利用镍离子Ni²⁺金属螯合亲和层析柱上复性方法大量获得纯化的重组微管蛋白；

所述纯化具体包括如下步骤：

a. 对重组微管蛋白进行大量表达，收集菌体沉淀：

b. 悬浮溶解上述沉淀，离心收集上清；

c. 利用镍离子纯化柱进行蛋白纯化：首先对纯化柱进行柱平衡，然后将包涵体溶液上样后再洗涤纯化柱；接着以低速用8M-0M尿素缓冲液对纯化柱进行线性梯度洗涤，使包涵体蛋白完成柱上复性，最后洗脱目标蛋白；

（3）高通量药物筛选方法的构建：棘球蚴重组α-微管蛋白同型和β-微管蛋白同型在0.25mg/mL~4mg/mL的浓度范围发生聚合，其聚合过程用酶标仪检测其动力学特征；将能产生最佳聚合效果的相应浓度的重组微管蛋白与待测药物进行共孵育，并利用酶标仪进行检测，观察重组微管蛋白聚合效率的变化，以检测待测药物对重组微管蛋白体外聚合的影响，以此筛选以棘球蚴微管蛋白为靶点的治疗棘球蚴病药物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述在强启动子T7的下游分别连接细粒棘球蚴和多房棘球蚴各14个α-微管蛋白同型基因Eg/EmTUA1~ Eg/EmTUA14和11个β-微管蛋白同型基因Eg/EmTUB1~ Eg/EmTUB11，具体为：在强启动子T7下游的多克隆位点处分别插入细粒棘球蚴和多房棘球蚴14个α-微管蛋白同型基因Eg/EmTUA1~Eg/EmTUA14和11个β-微管蛋白同型基因Eg/EmTUB1~Eg/EmTUB11，构建得到相应的重组载体，并对其进行测序验证。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述得到重组BL21-DE3细胞后对其进行培养并诱导表达，具体为：得到重组BL21-DE3细胞在含50μg/mL卡那霉素的LB培养基，37℃进行培养并用0.1~1mM IPTG诱导表达。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述得到重组BL21-DE3细胞后对其进行培养并诱导表达，具体为：将重组BL21-DE3细胞涂在含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养板上，于37℃倒置培养过夜，然后挑取单克隆于含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基内进行振摇培养至吸光度A₄₅₀值达到0.5-0.7时，加入诱导剂0.1~1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG进行诱导表达，待37℃振摇培养至吸光度A450值达到0.5-0.7后收集菌体，超声破碎大量获得以包涵体形式存在的重组微管蛋白。