[发明专利]一种植物腈水解酶突变体、编码基因及其应用

权利要求书

1.一种植物腈水解酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。

2.一种编码如权利要求1所述的植物腈水解酶突变体的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

3.一种包含如权利要求2所述的编码基因的重组载体。

4.一种包含如权利要求3所述的重组载体的重组基因工程菌。

5.如权利要求1所述的植物腈水解酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)针对芜菁腈水解酶基因序列，设计PCR引物，以高山南芥cDNA为模板，利用所述PCR引物扩增获得含有高山南芥腈水解酶核苷酸序列675-855位的DNA片段Ⅰ；

(2)以携带有芜菁腈水解酶基因的重组质粒为模板，利用反向PCR扩增获得芜菁腈水解酶核苷酸序列678-858位缺失的BrNIT质粒片段；

(3)将DNA片段Ⅰ和BrNIT质粒片段重组，再将重组产物转化至宿主菌，筛选获得重组后的亲本腈水解酶表达菌株，其中亲本腈水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(4)设计定点突变引物，以步骤(3)获得的携带有亲本腈水解酶基因的重组质粒为模板，进行重叠延伸PCR，获得亲本腈水解酶中第223位的L突变为Q或第263位的H突变为D或第279位的Q突变为E的单位点突变产物；

(5)以单位点突变产物为模板，利用所述定点突变引物进行重叠延伸PCR获得双位点突变产物；再以双位点突变产物为模板，利用所述定点引物进行重叠延伸PCR获得三位点突变产物；

(6)将所述三位点突变产物转化至宿主菌，筛选获得腈水解酶突变体表达菌株，诱导表达，获得所述的植物腈水解酶突变体。

6.如权利要求1所述的植物腈水解酶突变体在催化外消旋异丁基丁二腈制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用为以含有植物腈水解酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养后离心获得的湿菌体、湿菌体固定化细胞、湿菌体超声破碎后提取的酶或者固定化酶为催化剂，以外消旋异丁基丁二腈为底物，以pH为6-10的缓冲液为反应介质，在20-50℃、200-400rpm条件下水浴反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(S)-3-氰基-5-甲基己酸。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，反应体系中，底物的浓度为100-150g/L，催化剂的用量以湿菌体重量计为5-20g/L，其中湿菌体含水质量为70-90％。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述反应介质为pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液，催化反应温度为35℃。