[发明专利]一种用于塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗体检测的化学发光免疫分析试剂盒

权利要求书

1.一种用于塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗体检测的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗原包被的化学发光免疫分析板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标抗体、样品稀释液、化学发光底物液、发光增强剂以及浓缩洗涤液。

2.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗原经原核表达系统获得，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗原包被的化学发光免疫分析板按照以下方法制备得到：

(1)包被抗原的制备和包被

原核表达系统表达获得的重组蛋白包涵体经复性及Ni-NTA纯化得到塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，包被时用碳酸盐缓冲液稀释至2.5μg/ml，按照100μl/孔包被到化学发光免疫分析板上，4℃冰箱静置过夜；

(2)化学发光免疫分析板的封闭与保存

化学发光免疫分析板以PBST洗涤3次，每孔加入100μl含有5w/v％脱脂奶粉和0.01w/v％硫柳汞的封闭液，37℃封闭2h，弃掉封闭液，PBST洗涤3次，采用铝箔袋真空封口，4℃保存。

4.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述阳性对照血清是经塞尼卡谷病毒感染后14天的高感染滴度的猪血清；所述阴性对照血清是未免疫过任何疫苗的健康猪血清。

5.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG二抗。

6.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的样品稀释液为含1w/v％海藻糖、0.01w/v％硫柳汞、0.01v/v％Tween20和0.5w/v％酪蛋白的0.01M磷酸盐溶液。

7.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的化学发光底物液为用Tris-HCl缓冲液配制的含鲁米诺和对碘苯酚的混合液，所述的发光增强剂为用Tris-HCl缓冲液配制的含双氧水以及Tween20的混合液。

8.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的化学发光底物液为用0.05M Tris-HCl缓冲液配制的含0.1mmol/L鲁米诺和0.1mmol/L对碘苯酚的混合液，所述的发光增强剂为用0.05M Tris-HCl缓冲液配制的含7.5mmol/L双氧水、0.005v/v％Tween20的混合液。

9.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述的浓缩洗涤液为10×PBST溶液，即含有0.5v/v％Tween20的0.1mol/L PBS溶液，pH 7.4，使用时稀释10倍。

10.如权利要求1所述的化学发光免疫分析试剂盒，其特征在于，利用所述的试剂盒进行塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗体检测时，按照以下步骤进行：

(1)样本稀释

将待测样本、阳性对照血清以及阴性对照血清用样品稀释液按照体积比1：32进行稀释；

(2)洗板

从4℃冰箱中取出塞尼卡谷病毒非结构蛋白3ABC抗原包被的化学发光免疫分析板，打开铝箔袋，取出化学发光免疫分析板，以稀释好的洗涤液洗板3次，吸水纸拍干，每次3min；

(3)加样

将稀释后的待测样本、阳性对照血清以及阴性对照血清分别加入化学发光免疫分析板中，每孔100μL，37℃孵育5min；

(4)洗涤

取出化学发光免疫分析板，甩掉血清样品，用洗涤液漂洗4次，吸水纸拍干；

(5)加入酶标抗体

加入稀释好的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG二抗，100μL/孔，37℃工作5min；

(6)加底物：

甩掉酶标抗体，用洗涤液漂洗4次，吸水纸拍干，加入化学发光底物和发光增强剂，混匀，避光静置5min；

(7)测定发光值、计算和判定：

于化学发光免疫分析仪器上测定发光值，所有待测样品用阳性百分比表示(positivepercent，PP)，换算公式如下：

PP＝(待测样品发光值-阴性对照血清平均发光值)×100％/(阳性对照血清平均发光值-阴性对照血清平均发光值)

临界值定为7.27％，若计算结果≥7.27％则判定为阳性，反之则为阴性。