[发明专利]一种喉鳞状细胞癌易感性预测试剂盒及系统

权利要求书

1.一种喉鳞状细胞癌易感性预测试剂盒，其包括以下组分：STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物，所述STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物分别用于扩增包含下列短串联序列的目的片段，以确定下列短串联序列的重复次数：

位点代号	起始位置	所属基因	短串联序列
STR-1	X染色体，第66657655位	AR	CAG
STR-2	4号染色体，第55633758位	Bat-25	T
STR-3	5号染色体，第111646983位	D5S346	GT
STR-4	6号染色体，第151806531位	ER1	TA
STR-5	14号染色体，第64253561位	ER2	TG
STR-6	4号染色体，第154587748位	FGA	AAAG

所述STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物的序列如下所示：

其中，所述试剂盒还包括：PCR扩增反应液、LIZ-500分子量内标、去离子甲酰胺，以及使用说明书，

所述使用说明书记载了所述一种喉鳞状细胞癌易感性预测试剂盒的使用方法，其包括如下步骤：

(1)提取样本DNA；

(2)PCR反应

(2-1)从冰箱中取出STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物、PCR扩增反应液，平衡至室温，各组分充分溶解后，分别快速离心10秒；

(2-2)取30-300ng样本DNA，加入PCR扩增反应液60μL，加入去离子水补充至115.2μL，充分混匀，快速离心10秒，然后将混合液按照19.2μL/孔分装至6个PCR反应管中；

(2-3)将STR-1引物、STR-2引物、STR-3引物、STR-4引物、STR-5引物、STR-6引物按照0.8μL/孔分别加入到步骤(2-2)的6个PCR反应管中；盖好PCR反应管盖，记录样本加样情况，快速离心10秒，然后将PCR反应管转移至PCR扩增仪样本槽相应位置，并记录放置顺序，开始PCR扩增反应；扩增反应条件为：95℃3分钟；95℃30秒、60℃30秒、72℃30秒，10个循环；95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，20个循环；72℃6分钟，得到6组PCR扩增产物；

(3)STR片段分析

(3-1)取990μL去离子甲酰胺，加入10μL的LIZ-500分子量内标，充分混匀，快速离心10秒，按照10μL/孔分别加入到测序反应管中，快速离心10秒；

(3-2)将上述6组PCR扩增产物按照1μL/孔分别加入到6个测序反应管中，快速离心10秒；然后将测序反应管转移至PCR扩增仪样本槽相应位置，98℃加热5分钟，程序结束后立即将测序反应管置于冰水混合物上急速冷却至0℃，快速离心10秒；然后将测序反应管转移至STR位点片段分析仪样本槽相应位置，并记录放置顺序，进行片段分析检测；

(4)结果分析与判定

(4-1)根据片段分析结果，分别记录STR-1、STR-2、STR-3、STR-4、STR-5、STR-6各位点两个等位基因的片段长度：

STR-1两个等位基因中较小的片段长度值记为L₁，STR-1两个等位基因中较大的片段长度值记为L₂；

STR-2两个等位基因中较小的片段长度值记为L₃，STR-2两个等位基因中较大的片段长度值记为L₄；

STR-3两个等位基因中较小的片段长度值记为L₅，STR-3两个等位基因中较大的片段长度值记为L₆；

STR-4两个等位基因中较小的片段长度值记为L₇，STR-4两个等位基因中较大的片段长度值记为L₈；

STR-5两个等位基因中较小的片段长度值记为L₉，STR-5两个等位基因中较大的片段长度值记为L₁₀；

STR-6两个等位基因中较小的片段长度值记为L₁₁，STR-6两个等位基因中较大的片段长度值记为L₁₂；

(4-2)短串联序列的重复次数根据片段长度和如下公式计算得到，记作X₁-X₁₂，其中round代表四舍五入取整数：

X₁＝round[(L₁-191)/3]；X₂＝round[(L₂-191)/3]；

X₃＝round(L₃-379)；X₄＝round(L₄-379)；

X₅＝round[(L₅-202)/2]；X₆＝round[(L₆-202)/2]；

X₇＝round[(L₇-359)/2]；X₈＝round[(L₈-359)/2]；

X₉＝round[(L₉-278)/2]；X₁₀＝round[(L₁₀-278)/2]；

X₁₁＝round[(L₁₁-200)/4]；X₁₂＝round[(L₁₂-200)/4]；

(4-3)将上述短串联序列重复次数代入预先设置的判别函数：

F_LC＝10.750X₁-8.272X₂+14.088X₃+106.284X₄-0.418X₅+2.056X₆+2.288X₇+1.131X₈-0.466X₉-4.985X₁₀+2.407X₁₁+7.072X₁₂-15.282X₁₃-1550.869

F_LN＝11.048X₁-8.564X₂+14.325X₃+108.309X₄-0.776X₅+1.944X₆+2.347X₇+0.795X₈-0.807X₉-4.929X₁₀+2.523X₁₁+6.583X₁₂-18.780X₁₃-1581.097

其中，若受检对象为女性，则X₁₃＝0，若受检对象为男性，则X₁₃＝1；

(4-4)喉鳞状细胞癌易感性预测：

比较F_LC值和F_LN值，若F_LCF_LN，则预测受检对象罹患喉鳞状细胞癌的几率≥82.4％；若F_LC≤F_LN，则预测受检对象不罹患喉鳞状细胞癌的几率≥83.3％。