[发明专利]一种多糖测定分析方法及其应用

权利要求书

1.一种多糖中寡糖的测定分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）多糖酶解，使用内切酶对多糖样品进行酶解，获得酶解产物；

（2）衍生化，使用衍生化试剂对所述酶解产物进行衍生化处理；

（3）测定分析，采用UPLC-MS或/和UPLC-FLR对衍生化处理后的酶解产物进行分离、得到色谱图，随后对色谱峰特征信息进行分析，获得多糖信息，

步骤（3）中采用所述UPLC-FLR对衍生化处理后的酶解产物进行定量分析，选择标准低聚糖或纯化的酶解特征片段寡糖为对照品，根据色谱峰峰面积及保留时间，对多糖中的寡糖进行定量分析，

其中，步骤（1）中所述内切酶选自β-1,3(4)-葡聚糖内切酶、β-1,3-葡聚糖内切酶、β-1,4-半乳聚糖内切酶、右旋糖酐酶、阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、α-淀粉酶和异淀粉酶中的一种或多种，

步骤（2）中所述衍生化试剂选自2-氨基苯甲酰胺，

步骤（3）中UPLC-MS色谱条件如下：

a）色谱柱，Waters UPLC BEH Glycan，2.1 × 150mm id，1.7μm，柱温60℃，流动相为0.5%甲酸-水溶液A和乙腈B，梯度洗脱，程序为80% − 56% B，0 − 30 min，56% − 0% B，30–34 min，0%− 0% B，34 – 37 min，0%− 80% B，37 – 40 min，80% B平衡5 min，流速0.5 mL/min，进样量1 μL；

b）质谱条件，电喷雾离子化ESI，正离子模式，电压 + 4 kV, 氮气干燥气流速 10 L/min, 干燥温度 250 ℃，

步骤（3）中UPLC-FLR色谱条件如下：

a）色谱柱为Waters UPLC BEH Glycan，2.1 × 150 mm id，1.7 μm，柱温60℃，流动相为100 mM 甲酸铵，pH 4.5A和乙腈B，梯度洗脱，程序为25% − 50% A，0 – 46.5 min，50% −100% A，46.5– 48 min，100%A，48 – 49 min，100%− 25% A，49 – 50 min， 25% A平衡10min，流速0.5 mL/min，进样量1 μL；

b）荧光检测器，激发波长330 nm，检测波长420 nm。

2.如权利要求1所述的多糖中寡糖的测定分析方法，其中，步骤（2）包括以下步骤：

a）将衍生化试剂溶于DMSO/乙酸溶液中，获得的衍生化试剂浓度为0.01-0.2 M；

b）用步骤a）中获得的衍生化试剂溶液配制硼氢化钠溶液，使得硼氢化钠的最终浓度为0.1-1 M，配制完成后获得所述衍生化试剂溶液；

c）取步骤b）中获得的衍生化试剂溶液加入酶解后的酶解产物中，水浴反应，反应完成后，采用离心处理，取上清液与乙腈混合，混合后采用Glycoworks HILIC固相萃取柱去除其中过量的衍生化试剂，得到衍生化试剂衍生化后的酶解产物。

3.如权利要求1所述的多糖中寡糖的测定分析方法，其中，步骤（3）中采用所述UPLC-MS对衍生化处理后的酶解产物进行定性分析，根据色谱峰和保留时间，或以质谱色谱峰质荷比及二级质谱碎片特征，通过数据库比对进行色谱峰的识别与鉴定。

4.如权利要求1至3任一项所述的多糖中寡糖的测定分析方法在菌类中的应用。

5.如权利要求4所述的多糖中寡糖的测定分析方法在菌类中的应用，其中，所述菌类多糖样品的制备方法包括以下步骤：

（1）菌类多糖提取，将所述菌类干燥、打粉后加入水使得料液比1:20，水热平行提取，获得菌类初样；

（2）水提液浓缩，取步骤（1）中获得的菌类初样，加入乙醇沉淀，静置，离心，保留沉淀，加水复溶，冷冻干燥得到粗多糖；

（3）将步骤（2）中的粗多糖加去离子水配成溶液，转入超滤离心管，离心，弃滤液，采用苯酚-硫酸法跟踪检测滤液中糖含量，将截留液冷冻干燥，得到所述菌类多糖样品。