[发明专利]一种pnCasPA-BEC质粒及其应用

说明书

本发明提供了一种pnCasPA‑BEC质粒及其应用。所述的pnCasPA‑BEC质粒，其特征在于，含有能够表达APOBEC1‑nCas9的基因片段、假单胞菌中的质粒复制子mSF以及大肠杆菌中的质粒复制子ColE1。本发明能够高效并且快速地将各种假单胞菌株基因组上任意位点的胞嘧啶突变成胸腺嘧啶，实现氨基酸突变和基因失活等。所述技术在研究假单胞菌的生理特性、代谢产物、工业生产应用等方面具有广阔地应用前景。

技术领域

本发明涉及一种pnCasPA-BEC质粒及其应用。

背景技术

假单胞菌(Pseudomonas)是一种常见的革兰氏阴性变形杆菌，广泛存在于环境，例如泥土、水、植物和人体中。假单胞菌在生物化学、生态学及工业生产上都具有重要意义，是微生物研究的重点之一。例如，铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)是一种重要的人类病原菌，很容易造成囊性纤维化、严重烧伤。艾滋病、癌症等免疫力低下患者的临床感染。恶臭假单胞菌(P.putida)是一种常见的土壤细菌，已经被广泛应用于环境生物修复和高附加值化学物质生产。科学家们在代谢工程方面对恶臭假单胞菌进行了大量的研究，促进了其化学物质的生产能力和对恶劣环境的耐受性，使其具有很高的工业生产价值。而丁香假单胞菌(P.syringae)则是一种植物病原菌，是研究病原菌与植物之间相互关系的模式菌株。

假单胞菌的基础生理学研究和应用研究都需要快速高效的基因组编辑工具。但是假单胞菌中传统的基因组编辑仍然是一项费时费力的工作。CRISPR/Cas9系统是一种最新开发的基因编辑工具，它来源于细菌的免疫防御系统，目前已经被应用于一系列的生物体中，包括哺乳动物细胞、斑马鱼、酿酒酵母、大肠杆菌等。在这个系统中，Cas9核酸酶与引导RNA(sgRNA)结合形成复合物，通过sgRNA上的20个核苷酸与基因组上目标基因位点之间的碱基互补配对作用进行精确定位。在结合后，Cas9核酸酶会切割目标基因位点，在基因组上造成双链断裂。利用同源重组修复机制，CRISPR/Cas9系统能在一步操作中就实现精确的基因组编辑。

最近开发的碱基编辑器基于CRISPR/Cas9系统，能对基因组上的任意碱基进行编辑，为生物技术开创了一条新的基因组编辑道路。碱基编辑器主要是由一个缺陷型的Cas9蛋白(Cas9D10A或者Cas9D10AH840A)和一个结合到Cas9蛋白上的脱氨酶构成。在Cas9/sgRNA复合物的介导下，脱氨酶能够定位到基因组上的任意位点进行碱基编辑。这个系统直接通过脱氨反应催化碱基的转变，不产生DNA双链断裂，不需要同源修复模板。目前开发的胞嘧啶编辑器，将胞啶脱氨酶APOBEC1连接到缺陷型的Cas9D10A蛋白上，能够高效地将胞嘧啶(C)转变成胸腺嘧啶(T)。通过催化CAA、CAG、CGA、TGG转变成TAA、TAG、TGA，能够在目标基因上提前产生终止密码子，从而使基因失去活性。

碱基编辑器技术能够极为快速并且准确地靶向突变基因组上的碱基。伴随着大规模DNA微阵列合成技术的突破性发展，此技术能够在基因组层面或特定基因群实现大规模基因失活，大大提高了功能基因筛选的效率。目前，该技术已经在哺乳动物细胞、植物、大肠杆菌等生物体中实现了高效的碱基编辑，但在假单胞菌中还没有得到应用。因此通过工程化和改造碱基编辑器体系，使其能够适用于假单胞菌中的基因组碱基编辑，将极大简化假单胞菌的遗传学操作，还将提升功能性基因的筛选效率，为研究假单胞菌的基因功能提供了有力的工具，为后续的基因生物学功能研究、药物靶标发现、工业化改造等打下基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种pnCasPA-BEC质粒及其应用，其能够高效并且快速地将各种假单胞菌株基因组上任意位点的胞嘧啶突变成胸腺嘧啶，实现氨基酸突变和基因失活等。

为了达到上述目的，本发明提供了一种pnCasPA-BEC质粒，其特征在于，含有能够表达APOBECl-nCas9的基因片段以及假单胞菌中的质粒复制子(mSF)。

优选地，所述的pnCasPA-BEC质粒还含有大肠杆菌中的质粒复制子(ColEl)。