[发明专利]一种封闭式生物反应器及其细胞培养方法

权利要求书

1.一种封闭式生物反应器，其特征在于：包括溶液容器（1）、收集容器（2）、生物反应罐（3）、进液管道（4）和出液管道（5），所述进液管道（4）和出液管道（5）上各具有一个四通；

所述进液管道（4）的四通（40）的第一端口（41）与所述生物反应罐（3）的第一进液阀（31）连接，四通（40）的第二端口（42）与所述生物反应罐（3）的第二进液阀（32）连接，四通（40）的第三端口（43）和所述溶液容器（1）的出液端连接，四通（40）的第四端口（44）作为备用端口；

所述出液管道（5）的四通（50）的第一端口（51）与所述生物反应罐（3）的出液阀（33）连接，四通（50）的第二端口（52）与所述生物反应器罐（3）的排液阀（34）连接，四通（50）的第三端口（53）和所述收集容器（2）的进液端连接，四通（50）的第四端口（54）作为备用端口；

所述进液管道（4）的四通（40）的第一端口（41）与所述生物反应罐（3）的第一进液阀（31）之间采用硅胶管和灌流泵管相连；所述四通（40）的第二端口（42）与所述生物反应罐的第二进液阀（32）之间采用硅胶管和进液泵管相连；所述四通（40）的第三端口（43）和所述溶液容器（1）的出液端之间采用硅胶管相连；所述四通（40）的第四端口（44）通过硅胶管连接细胞悬液、毒种或者另一个溶液容器的出液端；

所述进液管道（4）的四通（40）的第一端口（41）与所述生物反应罐（3）的第一进液阀（31）之间的罐流泵管处设有进液精密蠕动泵（45）；所述四通（40）的第二端口（42）与所述生物反应罐（3）的第二进液阀（32）之间的进液泵管处设有进液工业蠕动泵（46）；

所述出液管道（5）的四通（50）的第一端口（51）与所述生物反应罐（3）的出液阀（33）之间采用硅胶管和灌流泵管相连；所述四通（50）的第二端口（52）与所述生物反应器罐（3）的排液阀（34）之间采用硅胶管和出液泵管相连；所述四通（50）的第三端口（53）和所述收集容器（2）的进液端之间采用硅胶管相连；所述四通（50）的第四端口（54）通过硅胶管连接另一个收集容器的进液端；

所述出液管道（5）的四通（50）的第一端口（51）与所述生物反应罐（3）的出液阀（33）之间的罐流泵管处设有出液精密蠕动泵（55）；所述四通（50）的第二端口（52）与所述生物反应器罐（3）的排液阀（34）之间的出液泵管处设有出液工业蠕动泵（56）；

所述进液管道（4）和出液管道（5）的四通（40，50）的每一个端口都设有止流夹。

2.如权利要求1所述的封闭式生物反应器，其特征在于：所述溶液容器（1）和收集容器（2）为具有支撑容器的一次性无菌袋；所述溶液容器（1）的出液端位于一次性无菌袋的底部，收集容器（2）的进液端位于一次性无菌袋的顶部。

3.如权利要求1所述的封闭式生物反应器，其特征在于：所述进液管道（4）和出液管道（5）的四通（40，50）由不锈钢或聚丙烯制成。

4.如权利要求1所述的封闭式生物反应器，其特征在于：所述生物反应罐（3）为固定床生物反应器罐。

5.一种采用如权利要求1至4任一项所述的封闭式生物反应器的细胞培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）预培养：打开生物反应罐（3）的排液阀（34），打开出液管道（5）的四通（50）的第二端口（52）和第三端口（53）的止流夹，启动出液工业蠕动泵（56）把生物反应罐（3）内的PBS溶液泵出到收集容器（2）；关闭生物反应罐（3）的排液阀（34），打开生物反应罐（3）的第二进液阀（32），打开进液管道（4）的四通（40）的第二端口（42）和第三端口（43）的止流夹，启动进液工业蠕动泵（46）把溶液容器（1）的培养液泵入到生物反应罐（3）内；开启生物反应器参数控制进行预培养；

2）生物反应器细胞接种：打开生物反应罐（3）的排液阀（34），打开出液管道（5）的四通（50）的第二端口（52）和第三端口（53）的止流夹，启动出液工业蠕动泵（56）把生物反应罐（3）内的预培养液泵出到收集容器（2）；关闭生物反应罐（3）的排液阀（34），打开生物反应罐（3）的第二进液阀（32），打开进液管道（4）的第二端口（42）和第三端口（43）的止流夹，启动进液工业蠕动泵（46）再次把溶液容器（1）的培养液泵入到生物反应罐（3）内；然后打开进液管道（4）的四通（40）的第二端口（42）和第四端口（44）的止流夹，启动进液工业蠕动泵（46）把细胞悬液泵入到生物反应罐（3）内；开启生物反应器参数控制完成生物反应器细胞接种操作；

3）生物反应器细胞灌流培养：打开生物反应罐（3）的出液阀（33）和第一进液阀（31），打开进液管道（4）的四通（40）的第一端口（41）和第三端口（43）的止流夹，打开出液管道（5）的四通（50）的第一端口（51）和第三端口（53）的止流夹，启动进液精密蠕动泵（45）和出液精密蠕动泵（55）到相同泵速，根据细胞增殖情况从零开始逐渐增加泵速进行细胞灌流培养；培养液用完更换新的培养液，收集液收满更换新的收集袋；

4）生物反应器病毒接种：细胞增殖到一定密度后，打开生物反应罐（3）的排液阀（34），打开出液管道（5）的四通（50）的第二端口（52）和第三端口（53）的止流夹，启动出液工业蠕动泵（56）把生物反应罐（3）内的培养液泵出到收集容器（2）；关闭生物反应罐（3）的排液阀（34），打开生物反应罐（3）的第二进液阀（32），打开进液管道（4）的四通（40）的第二端口（42）和第三端口（43）的止流夹，启动进液工业蠕动泵（46）把溶液容器（1）的病毒接种液泵入到生物反应罐（3）内；然后打开进液管道（4）的四通（40）的第二端口（42）和第四端口（44）的止流夹，启动进液工业蠕动泵（46）把毒种泵入到生物反应罐（3）内；开启生物反应器参数控制完成生物反应器病毒接种操作；

5）生物反应器洗换：病毒接种后第二天，打开生物反应罐（3）的排液阀（34），打开出液管道（5）的四通（50）的第二端口（52）和第三端口（53）的止流夹，启动出液工业蠕动泵（56）把生物反应罐（3）内的溶液泵出到收集容器（2）；打开生物反应罐（3）的第二进液阀（32），打开进液管道（4）的四通（40）的第二端口（42）和第三端口（43）的止流夹，启动进液工业蠕动泵（46）把洗换液泵入到生物反应罐（3）内，然后搅拌10min，重复以上步骤4-6次；再次把生物反应罐（3）内的溶液泵出到收集容器（2），然后打开生物反应罐（3）的第二进液阀（32），打开进液管道（4）的四通（40）的第二端口（42）和第三端口（43）的止流夹，启动进液工业蠕动泵（46）把病毒培养液泵入到生物反应罐（3）内，开启生物反应器参数控制进行病毒培养；

6）生物反应器病毒灌流培养：打开生物反应罐（3）的出液阀（33）和第一进液阀（31），打开进液管道（4）的四通（40）的第一端口（41）和第三端口（43）的止流夹，打开出液管道（5）的四通（50）的第一端口（51）和第三端口（53）的止流夹，启动进液精密蠕动泵（45）和出液精密蠕动泵（55）到相同泵速，按生物反应器工作体积的2-5倍体积的泵速进行病毒灌流培养连续收获病毒液；培养液用完更换新的培养液，收获液收满更换新的收集袋；

其中，所述步骤1）中的培养液为含有3%-10%新生牛血清的199溶液；所述步骤4）中的病毒接种液为含有1%新生牛血清的199溶液；所述步骤5）中的洗换液为不含新生牛血清的199溶液或PBS溶液；所述步骤5）中的病毒培养液为含0.1%-0.5%人血白蛋白的199溶液。