[发明专利]一种淡水砂梨组培苗试管内微嫁接的方法

权利要求书

1.一种淡水砂梨组培苗试管内微嫁接的方法，其特征在于，包括：

诱导培养步骤：将淡水砂梨外植体置于0.1％-0.3％的升汞溶液消毒10-16分钟，然后用无菌水冲洗5-6次，经无菌滤纸吸干水分后，用接种刀切成带1-3个顶芽和/或侧芽的长为0.5-2cm的带芽茎段，将所述带芽茎段为外植体接种到已灭菌并凝固的诱导培养基上，将接种后的诱导培养基先暗培养5-10天，再在光培养条件下诱导外植体茎段的顶芽或侧芽萌发，形成无菌试管苗；

继代增殖步骤：在无菌条件下将诱导培养的高为2-4cm的无菌试管苗用接种刀切下转接到已灭菌并凝固的增殖培养基上进行增殖，并进行光培养30-40天，促无菌试管苗的侧芽或不定芽萌发获得丛生的无根组培苗，将无根组培苗在无菌条件下用接种刀切分为单株组培苗，选取高于1.5cm的单株组培苗转接到增殖培养基上，多次继代培养获得无根组培苗，经继代培养30-40天后的无根组培苗作为微嫁接的接穗；

砧木培养步骤：将后熟处理过的棠梨种子用缓慢流水冲洗30-60分钟，晾干后用70％乙醇处理30s，无菌水冲洗3次后沥干，用0.1％-0.3％升汞溶液消毒4-8分钟，消毒结束用无菌水漂洗5-6次，然后接种到已灭菌并凝固的种子萌发培养基上，将接种后的种子萌发培养基先暗培养5-10天，然后在光培养条件下诱导种子萌发，形成无菌的棠梨幼苗，棠梨幼苗生长到第二片真叶形成时作为微嫁接的砧木；

试管内微嫁接步骤：将锡纸裁成0.5cm×1.5cm的条形，经高压灭菌后备用；在无菌条件下，取出砧木将其截顶，留3-4cm长的茎，将底部侧芽和叶片用镊子摘除，沿砧木茎段顶部纵切形成长度为0.4-0.6cm的切口；选取高度为2-5cm、粗度与砧木茎段相近的接穗，在接穗的顶部留2-6片叶子，并将其基部削成长度为0.4-0.6cm的楔形结构，将接穗的楔形基部插入砧木苗茎段的切口中，使切口密贴，砧木和接穗至少有一边的边缘对齐，用锡纸将嫁接口绑缚，获得微嫁接苗；并将微嫁接苗放入已灭菌并冷却至室温的盛有液体培养基的试管中，液体培养基占试管体积的1/4，液体培养基表面放入锡纸以固定嫁接苗使液体不没过嫁接苗的根茎部位，用无菌封口膜封住试管口，将微嫁接苗进行光培养促嫁接口愈合和幼苗生长；

炼苗移栽步骤：将嫁接苗光培养15天后，当砧木根部开始生长，且接穗叶片呈正常叶色并有新叶生长时将试管置于自然光中炼苗10-15天，再去除封口膜炼苗1天后，移栽于体积比为2:1的泥炭和珍珠岩混合物的栽培基质中，移栽后在封闭的塑料拱棚内保温保湿培养，一周后逐渐通风，直至去掉塑料拱棚。

2.根据权利要求1所述的淡水砂梨组培苗试管内微嫁接的方法，其特征在于：在所述诱导培养步骤之前还包括外植体预处理步骤，所述淡水砂梨外植体由淡水砂梨新梢经外植体预处理步骤后形成，所述外植体预处理步骤为：

将采集的长为5-10cm的淡水砂梨新梢冲洗干净表面杂物后置于饱和的洗衣粉溶液中浸泡5-10分钟，换净水漂洗3-5次后置于流动自来水中冲洗5-12小时，最后用封口袋密封装好置于4-10℃冰箱中备用。

3.根据权利要求1所述的淡水砂梨组培苗试管内微嫁接的方法，其特征在于：在诱导培养步骤中，所述带芽茎段为带包含顶芽或侧芽的单个芽的茎段、带包含顶芽和侧芽或均为侧芽的两个芽的茎段或者带包含顶芽和侧芽的三个芽的茎段。

4.根据权利要求1所述的淡水砂梨组培苗试管内微嫁接的方法，其特征在于：在砧木培养步骤之前还包括后熟处理步骤：棠梨果实成熟时采集无病虫害、发育良好的果实放于室外堆放沤烂，堆放的高度20-30cm，使果实堆积中心处不发热损伤种子，等果实软熟后，捣烂果实，水洗去掉腐烂的果肉和浮水的不饱满种子，将干净种子置阴凉通风荫干后装入塑料封口袋放入2-4℃冰箱保存30天后备用。

5.根据权利要求1所述的淡水砂梨组培苗试管内微嫁接的方法，其特征在于：所述暗培养为培养温度在23-27℃的条件下无光照的培养；所述光培养为培养温度在23-27℃的条件下每天光照12-16小时，光照强度1500-2100lx的培养。