[发明专利]一种基于CdSe量子点电致化学发光传感器的研制及其应用

权利要求书

1.一种基于CdSe量子点电致化学发光传感器，其特征是：在金电极表面连接电化学发光信号探针与封闭的DNA walker，通过DNA酶辅助目标循环和酶驱动的识别剪切双重放大策略，构建电致化学发光生物传感器。

2.一种制备权利要求1所述的CdSe量子点电化学发光信号探针的方法，其特征由下列步骤组成：

步骤1.Se前驱体的制备：Se前驱体制备采用了硼氢化钠还原硒粉来制备硒氢化钠。将95mg的NaBH₄和79mg的Se粉加入到离心管中，盖上顶部扎有小孔的盖子，通氮气除氧10min。然后加入6mL除氧后的二次水，置于温水浴中进行反应。待Se粉完全溶解之后，离心管中的液体变得澄清即制得Se前驱体溶液。

步骤2.Cd前驱体的制备：在三口烧瓶中将0.5709g的CdCl₂溶解于50mL的二次水中，搅拌直至溶解。通氮气进行除氧30min之后，将40μL的MPA注射进去，溶液立即生成大量的白色沉淀。接着再用预先配置好的1.0M的氢氧化钠溶液将反应溶液的pH调至9，继续通氮气至少30min，得到Cd前驱体。

步骤3.CdSe量子点的合成：在氮气保护下，取适量的Se前驱体反应溶液迅速注入含Cd前驱体的溶液中。将混合液充分搅拌并加热至沸腾1h，即制得橙黄色的澄清透明的CdSe溶胶。最后停止加热，搅拌下令其自然冷却至室温，收集反应产物4℃保存备用。

3.一种制备权利要求1所述的电极表面DNA walker的电致化学发光传感器的方法，其特征由下列步骤组成：

步骤1.目标引发多重循环放大：具体的目标引发的多重放大反应分两步进行。第一步，将10μL的各个浓度的目标物miRNA-21溶液，10μL浓度为1μM的HP1和10μL浓度为1μM的helper1混合，将上述混合液在90℃水浴5min，然后在室温下自然冷却。第二步，向第一步反应完的混合液中加入6μL的dNTPs(10mM)，5U的Nt.BbvCI核酸内切酶，5U的phi29聚合酶，6μL的各自对应的缓冲液(10X)，10μL的HP2(1μM)和10μL的辅助helper2(1μM)，将上述的混合液再置于37℃的摇床中反应90min。经过酶辅助的聚合剪切循环放大之后就会产生大量的trigger DNA，将反应的酶进行灭活处理之后置于4℃保存备用。

步骤2.电极的预处理：依次用1.0μm，0.3μm和0.05μm的α-Al₂O₃泥浆对金电极进行表面抛光。然后用二次水冲洗表面，接着分别再用二次水、乙醇、二次水进行超声洗涤，最后用N₂吹干。接下来使用电化学方法对电极进行表面清洗，设定扫描范围为0～1.5V，将电极置于0.5M的硫酸溶液中得到一个稳定的循环伏安峰曲线。最后将电极表面用二次水冲洗干净，用氮气吹干备用。

步骤3.传感器的构建：在处理好的金电极表面，用移液器吸取10μL纯化的纳米金溶胶，滴到电极的表面，置于避光处自然晾干。之后将Walker DNA-blocking DNA溶液与probeDNA以1:9的比例均匀混合之后，取10μL的混合液滴到纳米金修饰的电极表面，继续暗处反应16h。反应完成之后，将电极表面用二次水小心的冲洗再用氮气吹干。接下来将电极用MCH进行封板处理2h，使得DNA在电极表面保持直立状态利于进行下一步的杂交识别反应。反应完后，用PBS冲洗电极移除残余的MCH，然后，将电极浸在活化完的CdSe QDs溶液里面，通过探针DNA末端修饰的氨基与量子点表面活化的羧基进行结合，反应4h。反应完成之后用PBS冲洗以除去未结合的物质。最后，将修饰了量子点的电极浸在含有内切酶5U Nt.BbvCI及其对应缓冲溶液的循环放大反应溶液中，进行反应1h。最后取出电极，用缓冲液小心冲洗电极表面，检测ECL信号。

4.根据权利要求3所述的miRNA-21检测方法，其特征是：所述的电化学发光测试是以修饰好的金电极(基于CdSe量子点的电致化学发光传感器)为工作电极、Pt电极为对电极、甘汞电极为参比电极的三电极体系，用MPI-A型电致化学发光仪，在-1.5V到0进行循环伏安扫描，光电倍增管高压设为-600V。