[发明专利]利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法

权利要求书

1.一种利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：实验分组

用含有蒽环类药物方案化疗乳腺癌患者外周血，建立test组；

以未进行蒽环类药物处理的乳腺癌患者外周血，建立con组；

步骤2：RNA提取

提取test组和con组中外周血细胞的miRNA和靶基因；

步骤3：miRNA-gene芯片数据差异性表达分析

(1)导入每个miRNA探针的预设值；

(2)过滤掉在所有芯片的重复探针中Flag均为“-50”的miRNA探针；

(3)将每张芯片所含重复探针的荧光强度值取中位数；

(4)计算每张芯片中重复探针的变异系数值；

(5)芯片间采用Invariant set标准化法进行数据均一化，在同样本重复探针中取平均值；

(6)依据实验设计和分组情况对miRNA探针进行对比，计算|FC|1.4差异倍数；

(7)差异基因列表：选取满足|FC|1.4，P0.05的基因为差异基因；

(8)主成分和聚类分析：芯片讯号值经数据log转换及平均数中心化后，依需求筛选出适当数目的差异基因以平均连接算法进行聚类分析；

步骤4：miRNA靶基因分析及调控网络构建

利用Targetscan数据库对miRNA靶基因进行初步预测；利用DAVID数据库将miRNA靶基因进行KEGG通路富集分析，筛选出P＜0.05的基因通路。

2.根据权利要求1所述的利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法，其特征在于，步骤1中的分组具体为：

test组：乳腺癌患者化疗后外周血组，每组3个生物学重复；

con组：乳腺癌患者未化疗组外周血组，每组3个生物学重复。

3.根据权利要求1所述的利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法，其特征在于，步骤2具体包括以下步骤：

(1)在离心收集的冰冻细胞悬液中加入0.5mL的Trizon溶液，充分振荡混匀后，在室温下放置8min，保证细胞的核蛋白与核酸能完全分离；

(2)然后在细胞的核蛋白与核酸完全分离后，加氯仿0.2mL，祸旋振荡30s，在室温下放置2-3min，设置为在4℃下，离心速度12 000rpm，离心时间10min；

(3)使用100μL的枪头小心吸取上层水相的RNA移至干净的离心管中，按比例加入无水乙醇并混匀，再将溶液和半透明纤维悬浮物全部加至吸附柱中，静置约2min后，以12000rpm的离心速度离心3min后倒掉废液；

(4)将吸附柱放回收集管中，按比例加入RPE溶液，静置约2min，以10 000rpm的离心速度离心30s，离心后倒掉废液，重复此步骤一次；

(5)将吸附柱放回收集管中，1000rpm离心2min；再将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央处，按比例加入无酶水，放置5min，以12 000rpm的离心速度离心2min，离心后将所得到的液体为RNA溶液，使用分光光度仪检测RNA的浓度，并置于-80℃冰箱保存。

4.根据权利要求1所述的利用miRNA-gene共表达网络预测蒽环类药物心肌细胞间隙连接通讯异常的方法，其特征在于，步骤4还包括以下步骤：

进一步筛选出与肿瘤相关通路，并按可被miRNA调控的数量进行排序；将进一步筛选的通路相关靶基因进行整合，得到蒽环类药物干预下的miRNA的靶基因及miRNA-gene共表达基因；

筛选差异表达的miRNA和gene，筛选条件为|FC|1.4，score值175，中心度＜-36，P0.05。