[发明专利]一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌

说明书

本发明涉及一种高效表达α‑淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明的枯草芽孢杆菌工程菌以pHY300PLK为表达载体、以来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的高温α‑淀粉酶基因为目的基因、以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WS5为表达宿主，并在目的基因的上游插入了信号肽基因。利用本发明的枯草芽孢杆菌工程菌可高效表达α‑淀粉酶，将其作为生产菌株，摇瓶发酵48h，可将发酵液中α‑淀粉酶的酶活提高至732.1U/mL。

技术领域

本发明涉及一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

α-淀粉酶(α-amylase，EC.3.2.1.1)是一种重要的糖苷水解酶，其具有广泛的底物偏好性以及产物特异性，能切断淀粉以及相关α-葡聚糖分子中的α-1,4-葡萄糖苷键，并将淀粉水解为可溶性糊精、低聚糖及麦芽糖和葡萄糖，同时，其能够保留产物的α-异构体构象。

因此，α-淀粉酶被广泛应用于食品、洗涤、造纸、纺织、酒精和医药等行业。

根据作用温度的不同，α-淀粉酶也可分为高温、中温和低温α-淀粉酶。其中，高温α-淀粉酶具有良好的热稳定性，且来源广泛，可以从植物、动物和微生物中提取得到。植物、动物和微生物来源的α-淀粉酶中，微生物来源的高温α-淀粉酶在生产成本、发酵稳定性和生产时间等方面均比其他来源的有更明显的优势；而在微生物来源的高温α-淀粉酶中，细菌来源的高温α-淀粉酶热稳定性优势更为明显。

因此，来源于细菌的高温α-淀粉酶具有巨大的应用前景。

目前，已经有很多文献研究了来源于不同细菌的高温α-淀粉酶在大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等细菌中异源表达的情况。高温α-淀粉酶在大肠杆菌中的表达量比在枯草芽孢杆菌中的高，但由于大肠杆菌在进行发酵产酶的过程中会产生内毒素等有害物质，对人体不利，大大限制了其应用；而枯草芽孢杆菌的细胞壁不含内毒素，是一种非致病的土壤微生物，已被美国食品药物管理局和中国相关部门认定为食品安全级菌株GRAS(Generallyrecognized as safe)，但高温α-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达的表达量与活性十分低。

上述缺陷均使得来源于细菌的高温α-淀粉酶在工业上难以得到广泛的应用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌。此枯草芽孢杆菌工程菌以pHY300PLK为表达载体、以来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的高温α-淀粉酶基因为目的基因、以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)WS5为表达宿主，并在目的基因的上游插入了信号肽基因。利用此枯草芽孢杆菌工程菌可高效表达α-淀粉酶，将其作为生产菌株，发酵48h，可将发酵液中α-淀粉酶的酶活提高至732.1U/mL。

本发明提供了一种高效表达α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌工程菌，所述工程菌包含重组质粒和表达宿主；所述重组质粒包含目的基因、信号肽基因以及表达载体；所述目的基因为α-淀粉酶基因；所述信号肽基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8；所述表达载体为pHY300PLK；所述表达宿主为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

在本发明的一种实施方式中，所述目的基因为来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的高温α-淀粉酶基因。

在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶的核苷酸序列为SEQ ID NO.9。

在本发明的一种实施方式中，所述目的基因的酶切位点为Sac I和Hind III。