[发明专利]一种快速测定乳粉中致病菌的方法

权利要求书

1.一种快速测定乳粉中致病菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、乳粉中核酸模板的提取：

取25g待检乳粉加入营养肉汤中36℃培养24小时，取1mL培养液，加入到1.5mL无菌离心管中，6000-8000r/min离心5-10min，吸弃上清，加入50μLDNA提取液，混匀后沸水浴5-10min，10000-12000r/min离心5-10min，取上清液作为核酸模板；

S2、寡核苷酸引物的合成：

查询沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌的特异保守基因，以此为靶基因设计、合成寡核苷酸引物；

S3、荧光定量PCR检测：

将步骤S1所得核酸模板分别加入装有步骤S2所得不同特异寡核苷酸引物对的小管中，再加入相应的荧光定量PCR试剂，在同一轮荧光定量PCR循环下，对乳粉中的沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌进行定量检测；

S4、检测分析：分析检测数据。

2.根据权利要求1所述的快速测定乳粉中致病菌的方法，其特征在于：在步骤S1中，取25g待检乳粉加入营养肉汤中36℃培养24小时，取1mL培养液，加入到1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，吸弃上清，加入50μLDNA提取液，混匀后沸水浴5min，12000r/min离心5min，取上清液作为核酸模板。

3.根据权利要求1所述的快速测定乳粉中致病菌的方法，其特征在于，步骤S2包括以下步骤：

1)登录GenBank，在核酸数据库中检索所述沙门氏菌、所述志贺氏菌、所述金黄色葡萄球菌的目的基因序列，逐个核对后筛选出测序质量较好的基因序列；

2)应用Primer Premier 5.0软件对步骤1)所得基因序列进行特异寡核苷酸引物设计；

3)将步骤2)所设计的候选序列递交到GenBank进行BLAST比较，筛选出特异性较好的序列进行寡核苷酸引物的合成。

4.根据权利要求1所述的快速测定乳粉中致病菌的方法，其特征在于：所述寡核苷酸引物的长度为18-28bp，碱基成分中G+C含量为40％-60％，所有所述寡核苷酸引物的退火温度Tm值为60-70℃。

5.根据权利要求1所述的快速测定乳粉中致病菌的方法，其特征在于：所述沙门氏菌、所述志贺氏菌、所述金黄色葡萄球菌的所述寡核苷酸引物的退火温度差为0-5℃。

6.根据权利要求3所述的快速测定乳粉中致病菌的方法，其特征在于：步骤1)检索到所述沙门氏菌的目的基因fimA序列，经过步骤2)设计及步骤3)的筛选后，合成所述寡核苷酸引物Sal-fim-1(5’–TACCAACCGGCAAGGCATAA-3’)和Sal-fim-2(5’-GACACCGCCGTTTAAGAAATG-3’)。

7.根据权利要求3所述的快速测定乳粉中致病菌的方法，其特征在于：步骤1)检索到所述志贺氏菌的目的基因ipaH序列，经过步骤2)设计及步骤3)的筛选后，合成所述寡核苷酸引物Sf-ipa-1(5’–CCGGGATAAAGTCAGAACTC-3’)和Sf-ipa-2(5’-CTCCCGACACGCCATAGAAA-3’)。

8.根据权利要求3所述的快速测定乳粉中致病菌的方法，其特征在于：步骤1)检索到所述金黄色葡萄球菌的目的基因16s RNA序列，经过步骤2)设计及步骤3)的筛选后，合成所述寡核苷酸引物Sa-16s-1(5’–CCTTATGACCTGGGCTACAC-3’)和Sa-16s-2(5’-AACGGTTTTATGAGATTAGCTCC-3’)。

9.根据权利要求1所述的快速测定乳粉中致病菌的方法，其特征在于：步骤S3所述荧光定量PCR的条件为：预变性温度为95℃、时间为30S，变性温度为95℃、时间为10S，退火温度为62℃、时间为1min，循环数为40。

10.根据权利要求1所述的快速测定乳粉中致病菌的方法，其特征在于：步骤S3所述荧光定量PCR试剂为SYBR荧光染料。