[发明专利]一种带有黄色或红色荧光蛋白标签的非洲爪蟾卵母细胞表达载体及应用

说明书

本发明公开了带有黄色或红色荧光标签的可用于非洲爪蟾卵母细胞表达的载体及应用，通过分子生物学手段对pGH19质粒进行改造，具体开发成含有增强型黄色或单体红色荧光蛋白标签且适合非洲爪蟾卵母细胞表达的载体pGH19‑EYFP或pGH19‑mRFP。本发明所述载体既可正常表达目的基因，又可通过荧光显微镜或共聚焦显微镜检测带有黄色或红色荧光标签的靶蛋白的分布情况和表达模式，为非洲爪蟾卵母细胞表达的蛋白情况提供更直观简洁的检测方式；可实时观察蛋白表达的时空动态；对于目的蛋白后期的提取、纯化、鉴定和功能性分析，仅需使用通用型抗体即可检测到靶标蛋白的表达情况，大大简化了实验流程，节省了实验时间和经济成本。

技术领域

本发明涉及分子生物学及基因工程领域。具体来说，涉及带有黄色或红色荧光标签的非洲爪蟾卵母细胞表达载体及应用。

背景技术

非洲爪蟾卵母细胞是一种功能强大、适用范围广的异源性表达体系，被广泛应用于外源性钙离子通道、氯离子通道、钾离子通道、钠离子通道、γ-氨基丁酸受体、谷氨酸受体、乙酰胆碱受体等异源蛋白的表达及其生理学和药理学特性的研究。它在探讨化合物的作用机制、评价和筛选靶标化合物的药效和安全性等方面发挥着重要作用，是生物学、医药学、神经学、农药学等领域研究中不可或缺的异源型表达系统。

黄色和红色荧光蛋白是指能在绿色光(500-565nm)激发下会发出黄色和红色荧光的蛋白质，已经作为新型报告基因在生物学的许多研究领域中得到应用。黄色荧光蛋白的突变体—增强型黄色荧光蛋白(Enhanced Yellow Fluorescent Protein，EYFP)和单体红色荧光蛋白(Monomeric Red Fluorescent Protein，mRFP)因其发光稳定、亮度和区分度高，因此被广泛应用于基因表达、细胞分化及蛋白质的体内定位和转运等研究。

pGH19质粒是一种含有多种限制性内切酶位点且应用广泛的蛋白质表达载体，因其启动子和终止子附近分别含有非洲爪蟾β-球珠蛋白的5’UTR和3’UTR碱基序列，能够在非洲爪蟾卵母细胞中成功地表达异源性蛋白质，所以被广泛应用于非洲爪蟾卵母细胞的异源表达研究。

利用pGH19质粒在非洲爪蟾卵母细胞中表达的蛋白质可通过电生理实验检测其生理学和药理学特性，但是不能在显微镜下观察目标蛋白表达与否及时空表达动态，无法进行有效的亚细胞定位和目的蛋白的纯化及鉴定，而针对目的蛋白特异性抗体的获取也需要消耗大量的时间和经济成本。

发明内容

本发明的目的在于提供带有黄色或红色荧光蛋白标签的非洲爪蟾卵母细胞表达载体，该载体既可以在非洲爪蟾卵母细胞中成功表达有活性的目的蛋白，又带有可直接镜检的黄色或红色荧光，能够对蛋白的表达进行实时监测和亚细胞定位，并可利用通用型抗体anti-EYFP和mRFP对表达蛋白进行纯化和检测不同亚基的结合模式，从而免去制备特异性抗体的时间和经济成本。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

带有黄色或红色荧光蛋白标签的非洲爪蟾卵母细胞表达载体，其特征在于该载体为带有修饰序列的EYFP或带有修饰序列的mRFP基因连接到pGH19质粒上获得；带有修饰序列的EYFP或带有修饰序列的mRFP基因具体为EYFP基因或mRFP基因的5’端加入限制性内切酶A的识别碱基序列和一段人工设计的酶切位点碱基序列，及3’端自身携带的限制性内切酶B的识别碱基序列。

所述人工设计的酶切位点碱基序列如SEQ ID NO.3所示，通过添加该序列的酶切位点，可以解决pGH19质粒插入EYFP和mRFP基因后无法插入目的基因的问题，且可以确保成功插入目的基因后，不会破坏EYFP和mRFP基因活性和pGH19质粒原有功能，即在保障pGH19质粒原有功能的前提下，又可使目的蛋白带有黄色或红色荧光标签。

本发明所述限制性内切酶A可以为EcoRI限制性内切酶、XmaI限制性内切酶、SmaI限制性内切酶、BamHI限制性内切酶、BstBI限制性内切酶、XhoI限制性内切酶或EcoRV限制性内切酶。