[发明专利]一种制备可实时检测间充质干细胞骨分化的细胞模型的方法

说明书

本公开提供了一种制备可实时检测间充质干细胞骨分化的细胞模型的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对骨分化相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、形成待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，通过PCR及测序并筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。通过上述技术方案，本发明可以实现在干细胞药物制备过程中，实时监测连续传代的细胞的成骨分化状态。

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种制备可实时检测间充质干 细胞骨分化的细胞模型的方法。

背景技术

间充质干细胞(MSCs)作为一种新型基因治疗的靶细胞有着广泛床应 用前景，其优势如下：(1)来源广泛，可从自体或异体获得，属于同种移 植，不涉及伦理问题；(2)易于培养，具有增殖能力，体内外均保持多向 分化潜能；(3)具有归巢组织损伤部位、分泌大量细胞因子的能力。但目 前的研究发现，供体的个体差异、取材年龄的不同所造成的分化潜能的差异 制约了间充质干细胞作为细胞移植药物的临床应用。如何在体外传代扩增及 分化过程中及时监测MSCs的分化状态也成为干细胞工业质控中的难点和瓶 颈。

CRISPR基因编辑技术通过在基因组特定位点进行精确的靶向性剪切， 形成DNA双链缺口(Double-strand breaks,DSBs)，通过细胞内非同源末端 链接(Non-homologousend joining,NHEJ)实现对原位基因的敲除，通过同 源重组(Homology directed repair,HDR)在外源基因模板存在的情况下，实 现点突变的引入与修复及大片段基因(如报告基因)的插入。如专利文献 CN105985985A中所述，利用CRISPR/Cas9系统构建慢病毒，对脐带来源的 MSCs中的免疫抗原B2M、炎症因子TNF-α进行敲除，从而实现降低异体 间充质干细胞免疫源性的目的。但在哺乳动物细胞中，NHEJ修复基因占主 导模式，实现基因敲除比实现基因敲入容易很多。且基因敲入的片段越大， 整合几率越低，技术实现更为困难。目前尚未见有在MSCs中进行大片段基 因敲入的报道。

发明内容

本公开的目的是实现对间充质干细胞骨分化的实时检测，提供可实时检 测间充质干细胞骨分化的细胞模型以进行药物筛选。

为了实现上述目的，本公开提供了一种制备可实时检测间充质干细胞骨 分化的细胞模型的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对骨分化相关基因 的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；所述骨分化相 关基因包括SPP1、COL1A1、BMP-2、Runx2、SLP1、IBSP及BGLAP中的 至少一种；所述骨分化相关基因的敲入位点为所述骨分化相关基因的最末一 个有义密码子和终止密码子之间；S2、将插入有模板DNA同源重组载体包 装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述模板DNA包括针对所 述骨分化相关基因的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源 臂序列和所述右同源臂序列之间插入有自剪切2A肽编码序列和荧光蛋白报 告基因，以使得定向敲入后形成编码由骨分化相关基因、2A肽和荧光蛋白 串联而成的融合蛋白的融合基因；S3、将间充质干细胞的悬液与所述RNP 复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；S4、在电转结束后 1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以 进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；S5、将所述转染后的培养物 极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向 敲入的单克隆细胞株。