[发明专利]抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的间充质干细胞及其制备方法和用途

说明书

本公开提供了一种制备抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的间充质干细胞的方法，该方法包括如下步骤：S1、将针对基因插入安全岛的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；S2、形成携带GPX7基因的待转染AAV病毒颗粒；S3、将干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转；S4、加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行的转染；S5、进行单克隆化培养并筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株；S6、扩增并定向诱导分化成为MSC。本公开还提供了上述方法制备得到的间充质干细胞及其用途。通过上述技术方案，本发明获得了一种抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的多能干细胞制备方案。

技术领域

本公开涉及医药生物技术领域，具体地涉及一种抵抗细胞衰老且具有调节血糖作用的间充质干细胞及其制备方法和用途。

背景技术

I型糖尿病是由胰岛β细胞自身免疫炎症所导致的β细胞破坏，患者体内由于胰岛细胞功能缺失，患者需要终身进行胰岛素注射治疗。最新结果显示，我国每年有13000例新发I型糖尿病，过去20年间，15岁以下儿童发病率增加近4倍。

研究发现间充质干细胞(MSCs)外泌体中的miRNA可缓解胰岛素抵抗。另外，MSCs还可以促进β细胞自噬，促进α细胞向β细胞转变，保护β细胞，促进β细胞再生。在上述两方面共同作用下，产生降糖效应。现阶段国内间充质干细胞疗法的细胞来源主要分为自体来源(骨髓、脂肪组织等)和异体来源(脐带、胎盘等)两种。但是，此两种来源的间充质干细胞，普遍存在着如下问题：(1)难以取材(特别是骨髓)；(2)保存期限较短；(3)随年龄增大间充质干细胞数量和扩增潜力显著降低，体外扩增更会加速间充质干细胞老化；(4)随年龄增大间充质干细胞分化潜力大幅衰退，例如：取自年轻人的间充质干细胞易分化成软骨等细胞，而取自老人的间充质干细胞分化倾向于脂肪细胞；(5)制备过程不易质控，例如：不同个体和同一个体不同组织器官部位来源的间充质干细胞差异非常大，无法预知。这些缺点很大程度上导致了成体来源的间充质干细胞作为干细胞药物，其质控过程缺乏可控性，其疗效存在不稳定性，从而限制了其作为细胞移植药物的临床应用。也就是说，间充质干细胞的复制性衰老的缺陷是限制其临床应用的技术障碍。

CRISPR基因编辑技术通过在基因组特定位点进行精确的靶向性剪切，形成DNA双链缺口(Double-strand breaks,DSBs)，通过细胞内非同源末端链接(Non-homologous endjoining,NHEJ)实现对原位基因的敲除，通过同源重组(Homology directed repair,HDR)在外源基因模板存在的情况下，实现点突变的引入与修复及大片段基因(如报告基因)的插入。如专利文献CN105985985A中所述，利用CRISPR/Cas9系统构建慢病毒，对脐带来源的MSCs中的免疫抗原B2M、炎症因子TNF-α进行敲除，从而实现降低异体间充质干细胞免疫源性的目的。但在哺乳动物细胞中，NHEJ修复基因占主导模式，实现基因敲除比实现基因敲入容易很多。且基因敲入的片段越大，整合几率越低，技术实现更为困难。目前尚未见有在MSCs中进行大片段基因敲入的报道。

发明内容

本公开的目的是克服间充质干细胞存在的易衰老的缺陷，获得一种能够抵抗细胞衰老及延长血糖调节作用时程的细胞治疗产品。