[发明专利]一种制备可实时检测间充质干细胞向成熟肝样细胞分化的细胞模型的方法

权利要求书

1.一种制备可实时检测间充质干细胞向成熟肝样细胞分化的细胞模型的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

S1、将针对肝样细胞相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合以形成RNP复合物；所述肝样细胞相关基因包括ALB和/或AFP；所述肝样细胞相关基因的敲入位点为所述肝样细胞相关基因的最末一个有义密码子和终止密码子之间；

S2、将插入有模板DNA同源重组载体包装到AAV病毒中，形成待转染AAV病毒颗粒；所述模板DNA包括针对所述肝样细胞相关基因的敲入位点的左同源臂序列和右同源臂序列，所述左同源臂序列和所述右同源臂序列之间插入有自剪切2A肽编码序列和荧光蛋白报告基因，以使得定向敲入后形成编码由肝样细胞相关基因、2A肽和荧光蛋白串联而成的融合蛋白的融合基因；

S3、将间充质干细胞的悬液与所述RNP复合物的悬液混合并进行电转，得到电转后的培养物；

S4、在电转结束后1-30分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行4-30小时的转染，得到转染后的培养物；

S5、将所述转染后的培养物极限稀释后进行单克隆化培养，并通过PCR及测序筛选出进行了基因定向敲入的单克隆细胞株。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述sgRNA带有化学修饰基团；所述化学修饰基团优选为甲基化学修饰基团或磷硫酰化学修饰基团；针对肝样细胞相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白的用量摩尔比为1:1至1:5。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，将针对肝样细胞相关基因的敲入位点的sgRNA和Cas9蛋白混合的时间为5-20分钟，温度为10-40℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S3中，所述间充质干细胞的悬液与所述RNP复合物混合时，相对于每10⁶个所述间充质干细胞，以sgRNA的量计，所述RNP复合物的用量为10-50μmol，所述间充质干细胞的悬液中，细胞浓度为(1-5)×10⁷个/mL；以sgRNA的量计，所述RNP复合物的终浓度为0.1-1.5μmol/μL。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其中，步骤S3中，电转的条件包括：电场强度为50-250V/cm，单次脉冲时间为2-15ms，相邻两次脉冲之间的时间间隔为10-60s，总脉冲次数为2-10次。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤S4中，在电转结束后5-20分钟内，向所述电转后的物料中加入待转染的AAV病毒颗粒的悬液以进行8-24小时的转染，得到转染后的培养物。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其中，步骤S4中，待转染的AAV病毒颗粒的悬液的加入量使得待转染的AAV病毒颗粒的MOI值为10⁴-10⁶。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述间充质干细胞为胎盘间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、脐带间充质干细胞、宫血间充质干细胞及牙髓间充质干细胞，所述AAV病毒的血清型为AAV-6病毒、AAV-1病毒或AAV9病毒。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述自剪切2A肽为T2A肽、F2A肽和P2A肽中的至少一种；所述荧光蛋白报告基因为EGFP、ECFP、EYFP、GFP、RFP、mCherry、tdTomato和Venus中的至少一种。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，所述sgRNA如SEQ ID NO.1或4所示；相应地，所述左同源臂序列如SEQ ID NO.2或5所示；相应地，所述右同源臂序列如SEQ ID NO.3或6所示。